Peraturan ini mulai berlaku sejak tanggal diundangkan.
Agar setiap orang mengetahuinya, memerintahkan pengundangan Peraturan ini dengan penempatannya dalam Berita Negara Republik INDONESIA.
Ditetapkan di Jakarta pada tanggal 15 Agustus 2011 KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH Diundangkan di Jakarta pada tanggal 21 September 2011 MENTERI HUKUM DAN HAK ASASI MANUSIA REPUBLIK INDONESIA, PATRIALIS AKBAR www.djpp.kemenkumham.go.id
METODE ANALISIS PENETAPAN ANGKA KAPANG KHAMIR DAN UJI ANGKA LEMPENG TOTAL DALAM KOSMETIKA A. PENETAPAN ANGKA KAPANG DAN KHAMIR
1. Ruang lingkup Pedoman ini digunakan untuk MENETAPKAN angka kapang dan khamir dalam kosmetika dengan cara menghitung koloni dalam media agar selektif setelah inkubasi secara aerobik.
2. Prinsip
2.1.
Umum
2.1.1. Metode ini meliputi penghitungan kapang dan khamir pada media agar selektif.
2.1.2. Apabila diperkirakan contoh dapat menghambat pertumbuhan mikroba maka contoh harus dinetralkan supaya mikroba yang masih hidup dapat terdeteksi dan prosedur netralisasi harus divalidasi.
2.2.
Metode yang digunakan Penghitungan lempeng dengan:
2.1.3. Cara tuang atau sebar Penghitungan angka lempeng dilakukan dengan menginokulasikan secara langsung sejumlah tertentu dari suspensi awal atau yang telah diencerkan secara desimal ke dalam media spesifik dengan cara tuang atau sebar, dan diinkubasi secara aerob pada suhu yang sesuai dalam waktu tertentu. Jumlah mikroba dinyatakan dalam koloni atau cfu (colony forming units) per mL atau per g produk.
Lampiran 1 Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik INDONESIA Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 www.djpp.kemenkumham.go.id
2.1.4. Penyaringan membran Penyaringan membran dilakukan dengan cara memindahkan sejumlah contoh ke dalam peralatan filtrasi yang telah dibasahi dengan sejumlah kecil pengencer yang steril, segera disaring dan dibilas.
Membran penyaring kemudian diletakkan di atas permukaan media agar spesifik serta diinkubasi pada suhu yang sesuai dalam waktu tertentu. Jumlah koloni dinyatakan dalam cfu kapang dan khamir per mL atau per g produk.
3. Pengencer, penetral dan media kultur
3.1.
Umum Jika air merupakan komponen formula, maka digunakan air suling atau air yang sudah dimurnikan untuk pengencer, bahan penetral dan media kultur. Berikut ini adalah pengencer, bahan penetral dan media kultur yang sesuai untuk penghitungan dan deteksi bakteri.
Bahan lain dapat digunakan jika telah dibuktikan kesesuaiannya.
3.2.
Pengencer penetral dan pengencer
3.2.1. Umum Pengencer digunakan untuk mendispersikan contoh. Bahan ini mengandung bahan penetral jika contoh yang akan di uji mengandung sifat anti mikroba dan efektifitas penetralan harus dibuktikan sebelum penghitungan.
3.2.2. Pengencer penetral Pengencer penetral yang digunakan adalah media Fluid Casein Digest Soy Lecithin Polysorbate 20 atau Soy Casein Digest Lecithin Polysorbate 20 Broth (SCDLP 20 Broth) dengan komposisi dan cara pembuatan tertera pada Apendiks A.1
3.2.3. Pengencer penetral lain Pengencer penetral lain yang sesuai dan dapat digunakan tertera pada Apendiks B dan C.
3.2.4. Pengencer Pengencer yang digunakan adalah cairan A dengan komposisi dan cara pembuatan tertera pada Apendiks A.2.
3.2.5. Pengencer lain Pengencer lain yang dapat digunakan tertera pada Apendiks D.
www.djpp.kemenkumham.go.id
3.3.
Pengencer untuk suspensi khamir (Tryptone Sodium Chloride Solution) Pengencer untuk suspensi khamir yang digunakan adalah larutan Tryptone Sodium Chloride dengan komposisi dan cara pembuatan tertera pada Apendiks A.3.
3.4.
Media
3.4.1. Umum Media kultur dapat disiapkan sesuai petunjuk atau dari kultur media dehidrat yang mengacu pada instruksi dari pabrik. Media siap pakai dapat digunakan jika komposisi dan/atau hasil pertumbuhannya sebanding dengan formula berikut ini.
3.4.2. Media untuk penghitungan
3.4.3. Media Soybean Casein Digest Agar (SCDA), dengan komposisi dan pembuatan dapat dilihat pada Apendiks A.4.
3.4.3.1. Media lain yang dapat digunakan dilihat pada Apendiks F.
3.4.3.2. Media agar untuk kultivasi galur pembanding : media Sabouroud Dextrose Agar (SDA), komposisi dan pembuatan dapat dilihat pada Apendiks A.8.
4. Peralatan dan alat gelas Inkubator 22,5 ± 2,5 ºC Alat hitung koloni Perlengkapan laboratorium, peralatan dan alat gelas yang umum digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.
5. Galur mikroba Untuk validasi kondisi pengujian, dapat digunakan galur:
5.1.
Candida albicans ATCC 102311) atau galur yang setara
5.1.1 . Candida albicans IP 48.723) atau
5.1.2 . Candida albicans NCPF 31794) atau
5.1.3 . Candida albicans NBRC5) 1594 atau KCTC6) 17205 atau
5.1.4 . Candida albicans TISTR 5779 atau
5.1.5 . galur koleksi nasional yang setara.
5.2.
Galur khamir terpilih yang dianggap lebih sensitif terhadap aktivitas mikroba dibandingkan dengan kapang, dapat diterima sebagai perwakilan jamur (khamir dan kapang) untuk validasi metode.
www.djpp.kemenkumham.go.id
Walaupun dalam kasus tertentu, diperlukan pengujian efektivitas bahan penetral yang dilakukan dengan penambahan galur jamur pembanding, menggunakan protokol yang sesuai untuk penyiapan inokulum terkalibrasi.
Galur harus diremajakan sesuai prosedur yang diberikan oleh pemasok galur dan harus disimpan di dalam laboratorium sesuai dengan standar.
6. Penanganan Produk kosmetika dan contoh Produk yang akan diuji disimpan pada suhu ruang, tidak diinkubasi, didinginkan atau dibekukan sebelum dan sesudah analisis.
7. Prosedur Bahan dan peralatan steril serta teknik aseptik digunakan untuk menyiapkan contoh.
Untuk penyiapan suspensi awal, waktu antara selesainya penyiapan suspensi awal dan waktu inokulasi tidak boleh lebih dari 45 menit, kecuali dinyatakan lain dalam dokumen atau protokol yang berlaku.
7.1. Penyiapan suspensi awal Suspensi awal disiapkan dari contoh, minimal 1 g atau 1 mL dari campuran homogen produk yang diuji.
Suspensi awal biasanya dibuat dengan pengenceran 1:10. Volume pengencer atau media pengkaya mungkin diperlukan lebih banyak jika pada pengenceran 1:10 tingkat kontaminasi masih tinggi dan/atau efek antimikroba masih ada.
7.1.1.
Produk yang dapat bercampur dengan air Contoh dari produk dipindahkan ke dalam sejumlah volume tertentu pengencer penetral atau pengencer.
7.1.2.
Produk yang tidak dapat bercampur dengan air Contoh dari produk dipindahkan ke dalam wadah yang berisi sejumlah tertentu bahan peningkat kelarutan (misal larutan polisorbat 80), didispersikan dan ditambah sejumlah volume tertentu pengencer penetral atau pengencer, media pengkaya, tergantung metode yang digunakan.
www.djpp.kemenkumham.go.id
7.2. Metode penghitungan
7.2.1.
Pengenceran untuk metode penghitungan Suspensi awal umumnya adalah pengenceran pertama yang dihitung.
Jika diperlukan, dapat dibuat seri pengenceran selanjutnya dengan menggunakan pengencer yang sama sesuai dengan tingkat kontaminasi produk yang diperkirakan.
Penghitungan umumnya dilakukan menggunakan minimal 2 cawan Petri.
Namun untuk pengujian rutin boleh menggunakan satu cawan Petri, atau jika penghitungan dilakukan pada pengenceran yang berurutan dari contoh yang sama, atau mengacu pada hasil sebelumnya.
7.2.2.
Metode Penghitungan Lempeng
7.2.2.1.
Cara tuang Dalam cawan Petri berdiameter 85-100 mm, diinokulasikan dengan 1 mL suspensi awal dan/atau pengenceran contoh seperti yang disiapkan pada proses validasi (lihat prosedur penetralan aktifitas antimikroba produk) dan kemudian dituangkan 15-20 mL media agar (suhu tidak lebih dari 48°C). Suspensi awal dan/atau pengenceran contoh dicampur dengan media, digoyang dengan hati-hati atau dimiringkan secukupnya supaya terdispersi dengan baik. Campuran dalam cawan Petri dibiarkan memadat pada suhu ruang (Apendiks H.1).
7.2.2.2.
Cara sebar permukaan Dalam cawan Petri berdiameter 85-100 mm, dimasukkan 15-20 mL media agar (suhu tidak lebih dari 48°C).
Media agar dibiarkan dingin dan memadat di dalam inkubator, selanjutnya tidak kurang dari 0,1 mL suspensi awal dan/atau pengenceran contoh disebarkan pada permukaan media (Apendiks H.2).
7.2.2.3.
Cara penyaringan membran Sejumlah suspensi awal yang sesuai atau contoh yang telah diencerkan dituang ke dalam perangkat penyaring yang dilengkapi membran dengan ukuran pori 0,45 m, membran dibilas segera setelah penyaringan dan dipindahkan ke permukaan media agar (Apendiks H.3).
7.2.2.4.
Inkubasi www.djpp.kemenkumham.go.id
Kecuali dinyatakan lain, cawan Petri yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi pada 25 ºC±2,5 ºC selama 3-5 hari pada posisi dibalik. Segera diamati, jika tidak maka dapat disimpan dalam lemari pendingin maksimum 24 jam.
(Catatan: Pada kasus tertentu, dimana ada potensi menyebabkan keraguan dalam membedakan partikel produk dengan koloni yang dihitung, maka sebaiknya disiapkan cawan duplikat dengan pengenceran contoh dan media agar yang sama serta disimpan dalam lemari pendingin, sebagai pembanding cawan yang diinkubasi).
8. Pengamatan
8.1. Penghitungan koloni (Cara angka lempeng total dan penyaringan membran).
Setelah inkubasi, jumlah koloni dihitung sebagai berikut:
8.1.1.
Pada cawan Petri yang mengandung 15-150 koloni;
jika kurang dari 15 koloni dihitung seperti tertera pada 9.3.
8.1.2.
Pada membran yang mengandung 15-150 koloni; jika kurang dari 15 koloni dihitung seperti tertera pada 9.3.
9. Pernyataan hasil
9.1. Umum Bermacam-macam sifat dari angka lempeng harus dimasukkan dalam penghitungan. Dua hasil hanya dianggap berbeda jika selisihnya melebihi 50% atau ketika dinyatakan dalam logaritma, selisihnya melebihi 0,3.
Untuk penghitungan yang tepat, hanya dari cawan Petri dan penyaringan membran dengan koloni lebih dari 15 dan kurang dari 150 koloni.
Penghitungan yang diperoleh dari pengenceran yang tervalidasi harus diperiksa sesuai dengan metode yang dipilih.
9.2. Jika jumlah cfu lebih dari 15 dan kurang dari 150, hasil dinyatakan sebagai berikut :
Jika S minimal 1 g atau 1 mL dan V minimal 1 mL Jumlah khamir dan kapang per mL atau per g adalah = N/S Jika S < 1 g atau 1 mL, dan/atau V < dari 1 mL Jumlah khamir dan kapang dalam contoh 7) adalah = N www.djpp.kemenkumham.go.id
Dimana S adalah berat atau volume contoh (7.1) Hasil dinyatakan sebagai angka antara 1,0 dan 9,9 dikalikan dengan 10 pangkat (Lihat contoh 1, 2)
9.3. Jika jumlah cfu < 15, hasil dinyatakan sebagai berikut:
Jika S minimal 1 g atau 1 mL dan V minimal 1 mL Jumlah perkiraan khamir dan kapang per mL atau per g contoh adalah = N/S Jika S < 1 g atau 1 mL, dan/atau V < dari 1 mL Jumlah perkiraan khamir dan kapang dalam contoh adalah = N Jumlah contoh yang diuji dicatat dan dimasukkan ke dalam penghitungan S dan V, dimana S adalah berat atau volume contoh (7.1) Hasil dinyatakan sebagai angka antara 1,0 dan 9,9 dikalikan dengan 10 pangkat (lihat contoh 3)
9.4. Jika tidak ada koloni yang diamati, hasilnya dilaporkan sebagai berikut:
Kurang dari atau ≤(1/d) x V x S cfu khamir dan kapang per g atau mL produk (S minimal 1 g atau 1 mL) Kurang dari atau ≤1/(d x V) cfu khamir dan kapang pada contoh S (jumlah contoh yang diambil harus dicatat dan dimasukkan ke dalam penghitungan S dan V, serta S kurang dari 1 g atau 1 mL);
dimana d adalah faktor pengenceran dari suspensi awal (7.1) dan V adalah 1 (untuk penghitungan dengan cara tuang dan cara penyaringan membran) atau 0,1 (untuk cara sebar permukaan).
9.5. Contoh penghitungan Contoh 1. Dua cawan Petri atau dua membran penyaringan untuk satu pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 20 dan 16 maka rataannya adalah 18.
N = m/(Vxd) = 18/ (1 x 10-1 )= 18/0,1 = 180 = 1,8 x 102 cfu khamir dan kapang per g atau mL contoh Contoh 2. Satu cawan Petri atau satu membran penyaringan untuk satu pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 20, www.djpp.kemenkumham.go.id
N = c /(Vxd) = 20/ (1 x 10-1) = 20/0,1 = 200= 2 x 102 cfu khamir dan kapang per g atau mL contoh.
Contoh 3. Dua cawan Petri atau dua membran penyaringan untuk dua pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 120 dan 145, pengenceran 10-2 adalah 15 dan 25 N = xc /(Vx d) = (120 + 145 + 15 + 25) / [1 (2 + 0,1 x 2) x 10-1] = 305 /0,22 = 1386 atau 1.4 x 103 cfu khamir dan kapang per g atau mL contoh.
X adalah rata-rata dari koloni yang dihitung dari 2 pengenceran dan dihitung sbb :
xc = Σ c/(n1 + 0,1 n2) n1 adalah jumlah yang dihitung dari suspensi awal ( atau untuk pengenceran pertama) dan n2 adalah jumlah yang dihitung dari pengenceran 1/10 suspensi awal ( atau untuk pengenceran kedua) Contoh 4. Tidak ada koloni S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 0 dan 0 N ≤(1/d) x V x S ≤(1/0,1) x 1 x 1 ≤10 cfu khamir dan kapang per g atau mL produk
10. Netralisasi sifat antimikroba produk
10.1. Umum Pengujian berbeda yang dijelaskan berikut menunjukkan bahwa mikroba dapat tumbuh di bawah kondisi analisis.
10.2. Preparasi inokulum Sebelum pengujian, C. albicans diinokulasikan pada permukaan media agar non selektif Sabouraud Dextrose Agar (SDA), diinkubasi pada 32,5 ± 2,5 ºC selama 18-24 jam.
Untuk memanen kultur, digunakan jarum ose (sengkelit) steril yang digoreskan pada permukaan biakan dan kemudian diresuspensikan ke dalam pelarut untuk mendapatkan suspensi bakteri terkalibrasi lebih kurang 1 x 106 cfu per mL (diukur menggunakan spektrofotometer).
Suspensi ini dan pengencerannya dapat digunakan dalam waktu 2 jam www.djpp.kemenkumham.go.id
10.3. Validasi metode penghitungan
10.3.1. Prinsip Contoh yang telah dinetralkan (suspensi awal, atau pengencer contoh berdasarkan pada aktivitas anti mikroba atau rendahnya kelarutan produk) dicampur dengan pengenceran mikroba.
Campuran diinokulasikan pada cawan Petri atau disaring dengan penyaring membran.
Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dibandingkan terhadap kontrol (tanpa contoh).
Jika jumlah koloni kurang dari 50% atau 0,3 log dari kontrol, prosedur dimodifikasi (pengencer, zat penetral atau kombinasi keduanya, lihat Apendiks C). Kegagalan dari pertumbuhan inokulum tidak berlaku pada tes ini kecuali ada kemungkinan terjadi kontaminasi dari mikroba ini.
10.3.2. Validasi cara tuang Sejumlah 9 mL suspensi awal dan atau contoh yang telah diencerkan dalam pengencer yang bersifat menetralkan dicampur dengan 1 mL suspensi mikroba yang mengandung 1000-3000 CFU/mL. Sejumlah 1 mL dipipet ke dalam cawan Petri (dilakukan secara duplo) dan dituangkan 15-20 mL medium agar cair suhu tidak lebih dari 48°C. Pada saat yang bersamaan disiapkan cawan Petri kontrol menggunakan pengencer yang sama dan suspensi mikroba yang sama, tanpa contoh.
Setelah diinkubasi selama 72 ± 6 jam pada 22,5°C ± 2,5°C, jumlah koloni pada lempeng dihitung dan dibandingkan dengan jumlah yang diperoleh dari kontrol. Pengencer dan metode penghitungan divalidasi pada pengenceran 1:10 (ketika 1 mL suspensi awal digunakan), jika penghitungan hasil kurang dari 50% atau 0,3 log dari penghitungan kontrol.
10.3.3. Validasi cara sebar permukaan Sejumlah 9 mL suspensi awal dalam pengencer yang bersifat menetralkan (atau yang lain, lihat 3.2) dicampur dengan 1mL suspensi mikroba yang mengandung 10.000-30.000 cfu/mL (atau kurang jika 0,5 mL atau 1 mL yang disebarkan).
Kurang lebih 0,1 mL disebarkan pada permukaan lempeng agar padat (3.4.2.1) (dilakukan secara duplo).
Pada saat yang bersamaan disiapkan lempeng www.djpp.kemenkumham.go.id
kontrol menggunakan pengencer yang sama dan suspensi mikroba yang sama, tanpa contoh.
Setelah diinkubasi selama 72 ± 6 jam pada 22,5°C ± 2,5°C, jumlah koloni pada lempeng dihitung dan dibandingkan dengan jumlah yang diperoleh dari kontrol. Pengencer dan metode penghitungan divalidasi pada pengenceran 1:10 (ketika 1 mL suspensi awal digunakan), jika penghitungan hasil kurang dari 50% atau 0,3 log dari penghitungan kontrol.
10.3.4. Validasi cara penyaringan membran Sejumlah suspensi mikroba yang mengandung lebih kurang 100 cfu yang telah terkalibrasi dicampurkan pada sejumlah volume suspensi awal atau pengenceran contoh yang digunakan dalam pengujian (lihat 7.2.2.3) Seluruh volume campuran segera disaring menggunakan membran dan dibilas menggunakan sejumlah volume air (3.1), pengencer (3.2.4) atau pengencer yang dapat menetralkan (3.2.2). Membran kemudian dipindahkan ke permukaan media agar yang sesuai (3.4.2.1).
Pada saat yang sama , disiapkan kontrol pada kondisi yang sama seperti diatas tetapi tanpa produk.
Setelah diinkubasi selama 72 ± 6 jam pada 22,5°C ± 2,5°C, jumlah koloni pada lempeng dihitung dan dibandingkan dengan jumlah yang diperoleh dari kontrol. Pengencer dan metode penghitungan divalidasi pada pengenceran 1:10 (ketika 1 mL suspensi awal digunakan), jika penghitungan hasil kurang dari 50% atau 0,3 log dari penghitungan kontrol.
11. Laporan pengujian Laporan pengujian harus menjelaskan hal-hal berikut :
a. Semua informasi lengkap yang dibutuhkan untuk identifikasi produk;
b. Metode yang digunakan;
c. Hasil yang diperoleh;
d. Semua rincian proses untuk penyiapan suspensi awal;
e. Deskripsi metoda dengan bahan-bahan penetral dan media yang digunakan;
f. Validasi metoda, meskipun pengujian dilakukan terpisah.
www.djpp.kemenkumham.go.id
g. Hal-hal yang tidak diuraikan dalam dokumen ini, atau yang dianggap sebagai pilihan, bersama dengan rincian kejadian yang mungkin dapat mempengaruhi hasil.
B. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL
1. Ruang lingkup Pedoman ini digunakan untuk MENETAPKAN angka bakteri aerob mesofil yang masih memiliki daya hidup dalam produk kosmetika.
2. Prinsip
2.1. Umum
2.1.1. Metode ini meliputi penghitungan koloni bakteri pada media agar non selektif maupun ada atau tidaknya pertumbuhan bakteri setelah pengkayaan.
2.1.2. Apabila diperkirakan contoh dapat menghambat pertumbuhan mikroba maka contoh harus dinetralkan supaya mikroba yang masih hidup dapat terdeteksi dan prosedur netralisasi harus divalidasi.
2.2. Metode yang digunakan Penghitungan lempeng dengan:
2.2.1 Cara tuang atau sebar Penghitungan angka lempeng total dilakukan dengan menginokulasikan secara langsung sejumlah tertentu suspensi awal atau yang telah diencerkan secara desimal ke dalam media spesifik dengan cara tuang atau sebar, dan diinkubasi secara aerob pada suhu yang sesuai dalam waktu tertentu.
Jumlah mikroba dinyatakan dalam koloni atau cfu per mL atau per g produk.
2.2.2. Cara penyaringan membran Penyaringan membran dilakukan dengan cara memindahkan sejumlah contoh ke dalam peralatan penyaring (filtrasi) yang telah dibasahi dengan pengencer steril, segera disaring dan dibilas.
Membran penyaring kemudian diletakkan di atas permukaan media agar spesifik dan diinkubasi pada suhu yang sesuai dalam waktu tertentu. Jumlah mikroba dihitung dan angka lempeng total dinyatakan dalam koloni atau cfu per mL atau per g produk.
(Catatan : Cara penyaringan membran dilakukan untuk contoh yang mengandung pengawet, atau bahan antimikroba lain yang dapat larut).
www.djpp.kemenkumham.go.id
2.3. Deteksi bakteri dengan pengkayaan Deteksi dilakukan dengan cara menginokulasikan sejumlah contoh dalam media cair non selektif yang mengandung zat penetral dan/atau zat pendispersi, diinkubasi pada suhu yang sesuai dan waktu tertentu.
Sejumlah tertentu dari suspensi pengkayaan kemudian diinokulasikan pada media agar non selektif dan diinkubasi pada suhu yang sesuai dalam waktu tertentu.
Pertumbuhan bakteri dideteksi dan dinyatakan sebagai ada atau tidak adanya bakteri aerob mesofili per contoh dari produk.
3. Pengencer, penetral dan media kultur
3.1. Umum Jika air merupakan komponen formula, maka digunakan air suling atau air yang sudah dimurnikan untuk pengencer, bahan penetral dan media kultur. Berikut ini adalah pengencer, bahan penetral dan media kultur yang sesuai untuk penghitungan dan deteksi bakteri.
Bahan lain dapat digunakan jika telah dibuktikan kesesuaiannya.
3.2. Pengencer penetral dan pengencer
3.2.1. Umum Pengencer digunakan untuk mendispersikan contoh. Bahan ini mengandung bahan penetral jika contoh yang akan di uji mengandung sifat anti mikroba dan efektifitas penetralan harus dibuktikan sebelum penghitungan.
3.2.2. Pengencer penetral Pengencer penetral yang digunakan adalah media Fluid Casein Digest-Soy lecithin- Polysorbate 20 medium atau Soy Casein Digest Lecithin Polysorbate 20 Broth (SCDLP 20 Broth) dengan komposisi dan cara pembuatan tertera pada Apendiks A.1.
3.2.3. Pengencer penetral lain Pengencer penetral lain yang sesuai dan dapat digunakan tertera pada Apendiks B dan C.
3.2.4. Pengencer Pengencer yang digunakan adalah cairan A dengan komposisi dan cara pembuatan tertera pada Apendiks A.2.
3.2.5. Pengencer lain Pengencer lain yang dapat digunakan tertera pada Apendiks D.
www.djpp.kemenkumham.go.id
3.3. Pengencer untuk suspensi bakteri.
Pengencer untuk suspensi bakteri yang digunakan adalah larutan Tryptone Sodium Chloride dengan komposisi dan cara pembuatan tertera pada Apendiks A.3.
3.4. Media
3.4.1. Umum Media kultur dapat disiapkan sesuai petunjuk atau mengacu pada instruksi dari pabrik. Media siap pakai dapat digunakan jika komposisi dan/atau hasil pertumbuhannya sebanding dengan formula berikut ini.
3.4.2. Media untuk penghitungan
3.4.2.1.
Soybean Casein Digest Agar (SCDA) atau Tryptic Soy Agar (TSA) dengan komposisi dan pembuatan tertera pada Apendiks A.4.
3.4.2.2.
Media lain yang dapat digunakan tertera pada Apendiks E.
3.4.3. Media untuk deteksi Media pengkayaan dan media agar dapat digunakan untuk meningkatkan populasi mikroba awal. Media ini mengandung bahan penetral jika contoh yang diuji memiliki sifat antimikroba.
3.4.3.1. Media Pengkaya : Eugon LT 100 Broth Media ini mengandung bahan yang dapat menetralkan bahan penghambat yang ada dalam contoh (lesitin dan polisorbat 80) dan bahan pendispersi (oktosinol 9). Komposisi dan pembuatan tertera pada Apendiks A.5.
3.4.3.2. Media agar Eugon LT 100 dengan komposisi dan pembuatan tertera pada Apendiks A.6.
3.4.3.3.
Media agar lain Media lain yang dapat digunakan tertera pada Apendiks E.
3.4.3.4. Media agar untuk kultivasi mikroba pembanding Soybean Casein Digest Agar (SCDA) atau Tryptic Soy Agar (TSA) (Apendiks A.4).
4. Peralatan dan alat gelas Inkubator 32,5 2,5 oC Alat hitung koloni www.djpp.kemenkumham.go.id
Perlengkapan laboratorium, peralatan, dan alat gelas yang umum digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.
5. Galur mikroba pembanding Untuk validasi kondisi pengujian, dapat digunakan galur :
5.1.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 atau galur yang setara
5.1.1. Pseudomonas aeruginosa CIP 82.118 atau
5.1.2. Pseudomonas aeruginosa NCIMB 8626 atau
5.1.3. Pseudomonas aeruginosa NBRC 13275 atau
5.1.4. Pseudomonas aeruginosa KCTC atau
5.1.5. galur koleksi nasional yang setara
5.2.
Staphylococcus aureus ATCC1) 6538 atau galur yang setara :
5.1.6.
Staphylococcus aureus CIP 2) 4.83 atau
5.1.7.
Staphylococcus aureus NCIMB 3) atau
5.1.8.
Staphylococcus aureus NBRC 4) 13276 atau
5.1.9.
Staphylococcus aureus KCTC 5) 1916 atau
5.1.10.galur koleksi nasional yang setara Galur mikroba pembanding harus diremajakan sesuai prosedur yang diberikan oleh pemasok galur dan harus disimpan di dalam laboratorium sesuai dengan standar.
6. Penanganan kosmetika dan contoh Jika diperlukan, simpan kosmetika yang akan diuji pada suhu ruang.
Jangan diinkubasi, didinginkan atau dibekukan sebelum atau sesudah analisis.
7. Prosedur Bahan dan peralatan steril serta teknik aseptik digunakan untuk menyiapkan contoh.
Untuk penyiapan suspensi awal, waktu antara selesainya penyiapan suspensi awal dan waktu inokulasi tidak boleh lebih dari 45 menit, kecuali dinyatakan lain dalam dokumen atau protokol yang berlaku.
7.1. Penyiapan suspensi awal Suspensi awal disiapkan dari contoh, minimal 1 g atau 1 mL dari campuran homogen produk yang diuji.
www.djpp.kemenkumham.go.id
Suspensi awal biasanya dibuat dengan pengenceran 1:10. Volume pengencer atau media pengkaya diperlukan lebih banyak jika pada pengenceran 1:10 tingkat kontaminasi masih tinggi dan/atau efek antimikroba masih ada.
7.1.1.
Produk yang dapat bercampur dengan air Contoh dari produk dipindahkan ke dalam sejumlah volume tertentu pengencer penetral atau pengencer atau media pengkaya, tergantung pada cara yang digunakan.
7.1.2.
Produk yang tidak dapat bercampur dengan air Contoh dari produk dipindahkan ke dalam wadah yang berisi sejumlah tertentu bahan peningkat kelarutan (misal larutan polisorbat 80), ditambah sejumlah volume tertentu pengencer penetral atau pengencer atau media pengkaya, tergantung pada metode yang digunakan.
7.2. Metode Penghitungan
7.2.1.
Pengenceran untuk metode penghitungan Suspensi awal umumnya adalah pengenceran pertama yang dihitung.
Jika diperlukan, dapat dibuat seri pengenceran selanjutnya dengan menggunakan pengencer yang sama sesuai dengan tingkat kontaminasi produk yang diperkirakan.
Penghitungan umumnya dilakukan menggunakan minimal 2 cawan Petri.
Namun untuk pengujian rutin boleh menggunakan satu cawan Petri, atau jika penghitungan dilakukan pada pengenceran yang berurutan dari contoh yang sama, atau mengacu pada hasil sebelumnya.
7.2.1.
Metode Lempeng
7.2.2.1.
Cara tuang Dalam cawan Petri berdiameter 85-100 mm, diinokulasi dengan 1 mL suspensi awal dan/atau pengenceran contoh seperti yang disiapkan pada proses validasi (lihat prosedur penetralan aktivitas antimikroba produk) dan kemudian dituangkan 15- 20 mL media agar (suhu tidak lebih dari 48°C).
Suspensi awal dan/atau pengenceran contoh dicampur dengan media, digoyang dengan hati-hati atau dimiringkan secukupnya supaya terdispersi dengan baik. Campuran dalam cawan Petri dibiarkan memadat pada suhu ruang (Apendiks H.1).
7.2.2.2.
Cara sebar permukaan www.djpp.kemenkumham.go.id
Dalam cawan Petri berdiameter 85-100 mm, dimasukkan 15-20 mL media agar (suhu tidak lebih dari 48°C). Media agar dibiarkan dingin dan memadat di dalam inkubator, selanjutnya tidak kurang dari 0,1 mL suspensi awal dan/atau pengenceran contoh disebarkan pada permukaan media (Apendiks H.2).
7.2.2.3.
Cara penyaringan membran Sejumlah suspensi awal yang sesuai atau contoh yang telah diencerkan dituang ke dalam perangkat penyaring yang dilengkapi membran dengan ukuran pori 0,45 m, membran dibilas segera setelah penyaringan dan dipindahkan ke permukaan media agar (Apendiks H.3).
7.2.2.4.
Inkubasi Kecuali dinyatakan lain, cawan Petri yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi pada 32,5 ± 2,5 oC selama 72 ± 6 jam pada posisi dibalik.
Segera diamati, jika tidak maka dapat disimpan dalam lemari pendingin selama tidak lebih dari 24 jam.
(Catatan : Pada kasus tertentu, dimana ada potensi menyebabkan keraguan dalam membedakan partikel produk dengan koloni yang dihitung, maka sebaiknya disiapkan cawan duplikat dengan pengenceran contoh dan media agar yang sama serta disimpan dalam lemari pendingin, sebagai pembanding cawan yang diinkubasi).
7.3. Pengkayaan
7.3.1.
Umum Penyiapan suspensi awal dalam media pengkaya yang sesuai prosedur.
7.3.2.
Inkubasi contoh
7.3.2.1. Umum Inkubasi suspensi awal yang telah disiapkan pada 32,5 ± 2,5oC selama 20 jam.
7.3.2.2. Subkultur Sejumlah 0,1-0,5 mL suspensi yang telah diinkubasi, diinokulasi dengan menggunakan pipet steril, ke atas www.djpp.kemenkumham.go.id
permukaan cawan Petri berdiameter 85-100 mm yang berisi kurang lebih 15-20 mL media agar yang telah memadat.
7.3.2.3. Inkubasi subkultur Setelah suspensi meresap dalam media agar, diinkubasi pada 32,5 ± 2,5 oC selama 48-72 jam dengan posisi terbalik.
8. Pengamatan
8.1.
Penghitungan koloni (Cara lempeng dan penyaringan membran) Setelah inkubasi, jumlah koloni dihitung sebagai berikut:
8.1.1. Pada cawan Petri yang mengandung 30-300 koloni;
jika kurang dari 30 koloni dihitung seperti tertera pada 9.2.3.
8.1.2. Pada membran yang mengandung 15-150 koloni; jika kurang dari 15 koloni dihitung seperti tertera pada 9.2.3.
8.2.
Deteksi pertumbuhan (Cara pengkayaan) Setelah hasil subkultur diinkubasi, permukaan agar diamati dan dicatat ada atau tidaknya pertumbuhan bakteri.
9. Pernyataan hasil
9.1.
Cara perhitungan untuk Angka Lempeng Total Jumlah N mikroba yang ada di dalam contoh dihitung dengan menggunakan:
N = m/ (V x d)........(1) N = c/ (V x d).........(2) N = x c / (V x d)......(3) dimana :
m adalah rata-rata hitungan yang diperoleh dari pengamatan duplo V adalah jumlah volume inokulum yang dipindahkan ke masing- masing cawan Petri, dalam satuan mililiter d adalah faktor pengenceran dari pengenceran yang dibuat untuk preparasi suspensi awal (9.2) atau pengenceran pertama.
c adalah jumlah koloni yang terhitung pada Petri tunggal x c adalah rata-rata hitungan yang diperoleh dari dua pengenceran yang berturut-turut, dan dihitung sebagai berikut:
www.djpp.kemenkumham.go.id
x c = Σ c n1 + 0,1 n2 dimana:
Σ c adalah jumlah koloni terhitung pada semua cawan Petri yang diperoleh dari dua pengenceran berturut-turut n1 adalah jumlah yang terhitung pada cawan Petri untuk suspensi awal (atau untuk pengenceran pertama) n2 adalah jumlah yang terhitung pada cawan Petri untuk 1/10 dari suspensi awal (atau untuk pengenceran kedua) Hasil dibulatkan dalam 2 angka. Jika angka terakhir adalah di bawah 5, angka sebelumnya tidak diubah; jika angka terakhir adalah 5 atau lebih, angka sebelumnya dinaikkan satu unit.
Teruskan sampai diperoleh 2 angka yang signifikan. Catat jumlah N yang didapat.
9.2.
Interpretasi
9.2.1.Keragaman sifat dari perhitungan lempeng diambil untuk penghitungan.
Dua hasil dapat dianggap berbeda jika selisihnya melebihi 50 % atau ketika dinyatakan dalam logaritma, selisihnya melebihi 0,3.
Untuk penghitungan yang tepat, hanya cawan Petri dengan koloni lebih dari 30 dan kurang dari 300 untuk penghitungan cara tuang dan sebar permukaan.
Untuk penghitungan cara penyaringan membran, hanya membran dengan koloni lebih dari 15 dan kurang dari 150.
9.2.2.Jika jumlah koloni lebih dari 30 dan kurang dari 300 pada cawan Petri, atau lebih dari 15 dan kurang dari 150 pada membran, dimana S adalah massa atau volume contoh, hasil dinyatakan sebagai berikut :
Jika S adalah sedikitnya 1 g atau 1 mL, V sedikitnya 1 mL Jumlah bakteri aerob mesofil per mL atau per gram contoh adalah = N/S Jika S 1 g atau 1 mL, dan atau V 1 mL Jumlah bakteri aerob mesofil per mL atau per gram contoh adalah = N (jumlah contoh yang diambil untuk penghitungan S dan V harus dicatat).
Nyatakan hasil sebagai angka antara 1,0 dan 9,9 dikalikan dengan 10 pangkat (Lihat contoh 1,2,3 dan 7) www.djpp.kemenkumham.go.id
9.2.3.Jika jumlah koloni kurang dari 30 pada cawan Petri atau 15 pada membran, hasil dinyatakan sebagai berikut:
Jika S paling sedikit 1 g atau 1 mL, dan V paling sedikit 1 mL;
Jumlah perkiraan bakteri per mL atau per g contoh adalah N/S Jika S 1 g atau 1 mL, dan atau V 1 mL;
Bakteri per mL atau per g contoh adalah N Hasil dinyatakan sebagai angka antara 1,0 dan 9,9 dikalikan dengan faktor pengenceran ( misal 102, 103 dst) (lihat contoh 4, 5, dan 6)
9.2.4.Jika tidak ada koloni yang diamati, hasilnya dilaporkan sebagai berikut :
Kurang dari 1/(d x V x S) dari bakteri per mL atau per g produk (S minimal 1 g atau 1 mL);
Kurang dari 1/(d x V) dari bakteri pada contoh S (jumlah contoh yang diambil harus dicatat dan dimasukkan ke dalam penghitungan S dan V, serta S kurang dari 1 g atau 1 mL) dimana d adalah faktor pengenceran dari suspensi awal dan V adalah 1 (untuk penghitungan dengan cara tuang dan cara penyaringan membran) atau 0,1 (untuk cara sebar permukaan).
9.3.
Contoh penghitungan Contoh 1. Dua cawan Petri untuk satu pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 38 dan 42 maka rataannya adalah 40, menggunakan persamaan 1.
N = m/(Vxd) = 40/ (1 x 10-1 )= 40/0,1 = 400 = 4 x 102 cfu bakteri per g atau mL contoh Contoh 2. Satu cawan Petri untuk satu pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 60 menggunakan persamaan 2.
N = c /(Vxd) = 60/ (1 x 10-1) = 60/0,1 = 600= 6 x 102 cfu bakteri per gram atau mililiter contoh.
www.djpp.kemenkumham.go.id
Contoh 3. Dua cawan Petri untuk dua pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni pada pengenceran 10-2 adalah 235 dan 282, pada pengenceran 10-3 adalah 31 dan 39, menggunakan persamaan 3.
N = xc /(V x d) = (235 + 282 + 31 + 39) / [1 (2 + 0,1 x 2) x 10-2] = 587/0,022 = 26682 Hasil di atas dibulatkan menjadi 27000 atau 2,7 x 104 cfu bakteri per mL atau per g contoh.
Contoh 4. Dua membran penyaring untuk satu pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 18 dan 22 maka rataannya adalah 20, menggunakan persamaan 1.
N = m/(Vxd) = 20/ (1 x 10-1 )= 20/0,1 = 200 = 2 x 102 cfu bakteri per g atau mL contoh.
Contoh 5. Satu membran penyaring untuk satu pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 65, menggunakan persamaan 2.
N = c /(Vxd) = 65/ (1 x 10-1) = 65/0,1 = 650= 6,5 x 102 cfu bakteri per g atau mL contoh.
Contoh 6. Dua membran penyaring untuk dua pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 121dan 105, pengenceran 10-2 adalah 15 dan 25, menggunakan persamaan 3.
N =xc /(V x d) = (121 + 105 + 15 + 25)/ [1 (2 + 0,1 x 2) x 10-2 ] = 266/0,022 =1209 Hasil di atas dibulatkan menjadi 1200 atau 1,2 x 103 cfu bakteri per mL atau per gram contoh.
Contoh 7. Dua cawan Petri untuk satu pengenceran S= 1 g atau 1 mL; V = 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 28 dan 22 maka rataannya adalah 25, menggunakan persamaan 1.
www.djpp.kemenkumham.go.id
N = m /(Vxd) = 25/ (1 x 10-1 )= 25/0,1 = 250 Jumlah perkiraan adalah 250 atau 2,5 x 102 cfu bakteri per g atau mL contoh.
Contoh 8.
S = 1 g atau 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 0 dan 0, menggunakan persamaan 1 N ≤1 / ( V x d ) ≤1 / (1 x 10-1) ≤1 / 0,1 ≤10 Jumlah perkiraan adalah ≤10 cfu bakteri per g atau mL contoh.
Contoh 9.
S = 1 g atau 1 mL; Jumlah koloni yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 0 dan 3 maka rataanya adalah 1,5 menggunakan persamaan 1 N ≤m / ( V x d ) ≤1,5 / (1 x 10-1) ≤1,5 / 0,1 ≤15 Jumlah perkiraan adalah ≤15 cfu bakteri aerob mesofil per g atau mL sampel.
9.4.
Deteksi setelah pengkayaan Jika terdapat pertumbuhan (lihat ketentuan
8.2), hasilnya dinyatakan sebagai berikut:
”Terdapat bakteri aerob mesofil dalam contoh” Dan dilanjutkan dengan penghitungan menggunakan salah satu cara yang telah diuraikan (lihat 7.2).
www.djpp.kemenkumham.go.id
Jika tidak terdapat pertumbuhan (lihat ketentuan 8.2), hasilnya dinyatakan sebagai berikut:
”Tidak terdapat bakteri aerob mesofil dalam contoh”
10. Netralisasi sifat antimikroba produk
10.1. Umum Pengujian berbeda yang dijelaskan berikut menunjukkan bahwa mikroba dapat tumbuh di bawah kondisi analisis.
Dua galur (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538) digunakan untuk menunjukkan validitas sifat-sifat yang secara umum sensitif terhadap bahan antimikroba.
10.1. Preparasi inokulum Sebelum pengujian, kedua galur masing-masing diinokulasikan pada permukaan media Soybean Casein Digest Agar (SCDA) atau media lain yang sesuai (tidak selektif dan tidak menetralkan), kemudian diinkubasi pada 32,5ºC ± 2,5 ºC selama 18-24 jam. Untuk memanen kultur digunakan jarum ose (sengkelit) steril yang digoreskan pada permukaan biakan dan diresuspensikan ke dalam pelarut untuk mendapatkan suspensi bakteri terkalibrasi lebih kurang 1 x 108 cfu per mL (diukur menggunakan spektrofotometer).
Suspensi ini dan pengencerannya dapat digunakan dalam waktu 2 jam.
10.2. Validasi metode penghitungan
10.2.1. Prinsip Untuk masing-masing galur mikroba, contoh yang telah dinetralkan (suspensi awal, atau pengencer contoh berdasarkan pada aktivitas anti mikroba atau rendahnya kelarutan produk) dicampur dengan pengenceran mikroba. Campuran diinokulasikan pada cawan Petri atau disaring dengan penyaring membran.
Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dibandingkan terhadap kontrol (tanpa contoh).
Jika jumlah koloni kurang dari 50% atau 0,3 log dari kontrol, prosedur dimodifikasi (pengencer, zat penetral atau kombinasi keduanya).
Variasi sifat-sifat dari angka lempeng seharusnya diambil dalam penghitungan.
Dua hasil dianggap berbeda jika selisihnya melebihi 50% atau ketika dinyatakan dalam www.djpp.kemenkumham.go.id
logaritma, selisihnya melebihi 0,3.
Kegagalan dari pertumbuhan inokulum tidak berlaku pada uji ini kecuali ada kemungkinan terjadi kontaminasi dari mikroba ini.
10.2.2. Validasi cara tuang Sejumlah 9 mL suspensi awal dan atau contoh yang telah diencerkan dalam pengencer yang bersifat menetralkan dicampur dengan 1 mL suspensi mikroba yang mengandung 1000-3000 cfu/mL. Sejumlah 1 mL dipipet ke dalam cawan Petri (dilakukan secara duplo) dan kemudian dituangkan 15-20 mL medium agar cair suhu tidak lebih dari 48C. Pada saat yang bersamaan disiapkan cawan Petri kontrol menggunakan pengencer yang sama dan suspensi mikroba yang sama, tanpa contoh.
Setelah diinkubasi selama 24-72 jam pada 32,5°C ± 2,5°C, jumlah koloni pada lempeng dihitung dan dibandingkan dengan jumlah yang diperoleh dari kontrol.
Pengencer dan metode penghitungan divalidasi pada pengenceran 1:10 (ketika 1 mL suspensi awal digunakan), jika penghitungan hasil kurang dari 50% atau 0,3 log dari penghitungan kontrol.
10.2.3. Validasi cara sebar permukaan Sejumlah 9 mL suspensi awal dalam pengencer yang bersifat menetralkan (atau yang lain, lihat
3.1) dicampur dengan 1mL suspensi mikroba yang mengandung 10.000-30.000 cfu/mL (atau kurang jika 0,5 mL atau 1 mL yang disebarkan). Kurang lebih 0,1 mL disebarkan pada permukaan lempeng agar padat (3.4.2) (dilakukan secara duplo).
Pada saat yang bersamaan disiapkan lempeng kontrol menggunakan pengencer yang sama dan suspensi mikroba yang sama, tanpa contoh.
Setelah diinkubasi selama 24-72 jam pada 32,5°C ± 2,5°C, jumlah koloni pada lempeng dihitung dan dibandingkan dengan jumlah yang diperoleh dari kontrol.
Pengencer dan metode penghitungan divalidasi pada pengenceran 1:10 (ketika 1 mL suspensi awal digunakan), jika penghitungan hasil kurang dari 50% atau 0,3 log dari penghitungan kontrol.
www.djpp.kemenkumham.go.id
10.2.4. Validasi cara penyaringan membran Sejumlah suspensi mikroba yang mengandung lebih kurang 100 cfu yang telah terkalibrasi dicampurkan pada sejumlah volume suspensi awal atau pengenceran contoh yang digunakan dalam pengujian (lihat 7.2.2.3) Seluruh volume campuran segera disaring menggunakan membran dan dibilas menggunakan sejumlah volume air (3.1), pengencer (3.2.4) atau pengencer yang dapat menetralkan (3.2.2). Membran dipindahkan ke permukaan media agar yang sesuai (3.4.2).
Pada saat yang sama , disiapkan kontrol pada kondisi yang sama seperti diatas tetapi tanpa produk.
Setelah diinkubasi selama 24-72 jam pada 32,5°C ± 2,5°C, jumlah koloni pada lempeng dihitung dan dibandingkan dengan jumlah yang diperoleh dari kontrol.
Pengencer dan metode penghitungan divalidasi pada pengenceran 1:10 (ketika 1 mL suspensi awal digunakan), jika penghitungan hasil kurang dari 50% atau 0,3 log dari penghitungan kontrol.
10.3. Validasi cara deteksi dengan pengkayaan
10.4. Prosedur Masing-masing suspensi galur terkalibrasi diencerkan dengan 9 mL pengencer sehingga diperoleh jumlah bakteri antara 100- 500 CFU/mL.
Untuk menghitung konsentrasi akhir dari mikroba yang hidup dalam suspensi, sejumlah 1 mL suspensi dipindahkan ke dalam cawan Petri dan kemudian dituang 15- 20 mL media agar cair suhu tidak lebih dari 48ºC, kemudian diinkubasi pada 32,5°C ± 2,5°C selama 20-24 jam Suspensi awal contoh disiapkan secara duplo pada kondisi yang dipilih untuk pengujian (minimal 1 g atau 1 mL produk), media pengkaya dengan volume tertentu (3.4.3.1) dalam tabung atau Erlenmeyer.
Pada satu tabung (uji validasi), dimasukkan secara aseptik 0,1 ml suspensi mikroba terkalibrasi, kemudian masing-masing diinkubasi pada 32,5°C ± 2,5°C selama 20-24 jam.
Setelah diinkubasi masing-masing tabung atau Erlenmeyer dipipet sejumlah 0,1-0,5 mL dalam kondisi yang sama seperti www.djpp.kemenkumham.go.id
pada pengujian ke atas permukaan cawan Petri yang berisi lebih kurang 15-20 mL media agar yang sesuai dan diinkubasi pada 32,5°C ± 2,5°C selama 20-24 jam.
10.4.1. Interpretasi hasil
10.4.1.1. Harus dipastikan bahwa suspensi mengandung Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa masing-masing 100 cfu/mL.
10.4.1.2. Metode netralisasi dan deteksi dinyatakan valid jika karakteristik pertumbuhannya terdapat pada cawan validasi dan tidak terdapat pada cawan kontrol, sebagai berikut:
Staphylococcus aureus:
koloni berwarna kuning dan Pseudomonas aeruginosa: koloni berwarna kehijauan sampai kekuningan.
10.4.1.3. Jika pertumbuhan terdeteksi pada lempeng kontrol (produk terkontaminasi), metode netralisasi dan deteksi dinyatakan valid jika mikroba yang diinokulasi tumbuh pada lempeng validasi.
10.5. Interpretasi hasil validasi
10.5.1. Kegagalan pertumbuhan pada lempeng validasi mengindikasikan bahwa aktivitas anti mikroba masih ada, sehingga memerlukan modifikasi kondisi metode dengan cara meningkatkan volume media pertumbuhan tetapi jumlah produknya tetap sama, atau dengan penggabungan sejumlah bahan penetral pada media pertumbuhan, atau kombinasi dari modifikasi yang sesuai sehingga memungkinkan terjadinya pertumbuhan bakteri.
10.5.2. Apabila penggabungan dan peningkatan jumlah bahan dan bahan penetral dalam media pertumbuhan masih tidak memungkinkan untuk menumbuhkan kultur sebagaimana dijelaskan di atas, maka hal ini mengindikasikan bahwa contoh tidak terkontaminasi oleh bakteri.
11. Laporan pengujian Laporan pengujian harus menjelaskan hal-hal berikut :
a. Semua informasi lengkap yang dibutuhkan untuk identifikasi produk;
www.djpp.kemenkumham.go.id
b. Metode yang digunakan;
c. Hasil yang diperoleh;
d. Semua rincian proses untuk penyiapan suspensi awal;
e. Deskripsi metoda dengan bahan-bahan penetral dan media yang digunakan;
f. Validasi metoda, meskipun pengujian dilakukan terpisah;
g. Hal-hal yang tidak diuraikan dalam dokumen ini, atau yang dianggap sebagai pilihan, bersama dengan rincian kejadian yang mungkin dapat mempengaruhi hasil.
C. MEDIA, PENGENCER PENETRAL, TEHNIK DASAR UNTUK PENGHITUNGAN DAN PLATING SERTA PERSIAPAN DAN KALIBRASI INOKULUM APENDIKS A A.1. Fluid Casein Digest Soy Lecithin Polysorbate 20 (SCDLP 20 broth) Komposisi Pancreatic digest of casein 20,0 g Lesitin soya 5,0 g Polisorbat 20 40,0 g Air 960 mL Penyiapan Larutkan Polisorbat 20 ke dalam 960 mL air, dengan cara mencampur dan memanaskan pada 49±2°C. Tambahkan Pancreatic digest of casein dan lesitin soya kemudian dipanaskan kurang lebih 30 menit sampai larut. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,3 ± 0,2.
A.2. Cairan A Komposisi Peptic digest of animal tissue (pepton) 1,0 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan 1 gram pepton ke dalam air dengan cara menggoyang dan memanaskan. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi www.djpp.kemenkumham.go.id
dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,1 ± 0,2.
A.3. Tryptone Sodium Chloride Solution Komposisi Tryptone, pancreatic digest of casein 1 g Natrium klorida 8,5 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen ke dalam air dengan pemanasan. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,0 ± 0,2.
A.4. Soybean Casein Digest Agar (SCDA) atau Tryptic Soy Agar (TSA) Komposisi Pancreatic digest of casein 15,0 g Papaic digest of soybean meal 5,0 g Natrium klorida 5,0 g Agar 15,0 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen atau media lengkap yang dikeringkan ke dalam air dengan pemanasan. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,3 ± 0,2.
A.5.
Cairan pengkaya : Eugon LT 100 Broth Komposisi Pancreatic digest of casein 15,0 g Papaic digest of soybean meal 5,0 g L-sistin 0,7 g Natrium klorida 4,0 g Natrium sulfit 0,2 g www.djpp.kemenkumham.go.id
Glukosa 5,5 g Lesitin telur 1,0 g (zat penetral) Polisorbat 80 5,0 g (zat penetral) Oktosinol 9 1,0g (zat pendispersi) Air 1000 mL Penyiapan Larutkan Polisorbat 80, oktosinol 9, dan lesitin telur ke dalam air mendidih sampai terlarut sempurna.
Tambahkan komponen lain dengan pengadukan sambil dipanaskan. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,0 ± 0,2.
A.6. Eugon LT 100 Agar Komposisi Pancreatic digest of casein 15,0 g Papaic digest of soybean meal 5,0 g L-sistin 0,7 g Natrium klorida 4,0 g Natrium sulfit 0,2 g Glukosa 5,5 g Lesitin telur 1,0 g Polisorbat 80 5,0 g Oktosinol 9 1,0 g Agar 15,0 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan Polisorbat 80, oktosinol 9, dan lesitin telur ke dalam air mendidih sampai terlarut sempurna.
Tambahkan komponen lain dengan pemanasan, campurkan perlahan untuk menghindari terbentuknya busa. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai.
Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus 7,0 ± 0,2.
www.djpp.kemenkumham.go.id
A.7. Sabouraud Dextrose Chloramphenicol Agar (SDCA) Komposisi Dekstrosa 40 g Peptic digest of animal tissue 5,0 g Pancreatic digest of casein 5,0 g Kloramfenikol 0,05 g Agar 15 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen (termasuk kloramfenikol) atau media lengkap yang dikeringkan ke dalam air dengan cara mencampur dan memanaskan. Pindahkan ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121ºC selama 15 menit. Setelah sterilisasi, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 5,6±0,2.
A.8. Saboroud Dextrose Agar (SDA) Komposisi Dekstrosa 40 g Peptic digest of animal tissue 5,0 g Pancreatic digest of casein 5,0 g Agar 15 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan komponen atau media lengkap yang dikeringkan ke dalam air dengan cara mencampur dan memanaskan. Pindahkan ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121ºC selama 15 menit.
Setelah sterilisasi, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 5,6±0,2.
A.9. Cetrimide Agar Komposisi Pancreatic digest of gelatin 20,0 g Magnesium klorida 1,4 g Kalium sulfat 10,0 g Cetrimide (cetyltrimethylammonium bromide) 0,3 g Agar 13,6 g www.djpp.kemenkumham.go.id
Gliserin 10,0 mL Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen padat ke dalam air, dan tambahkan gliserin.
Panaskan, goyang secara teratur, dan didihkan selama 1 menit untuk melarutkannya.
Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai.
Sterilisasi dengan otoklaf pada 121C selama 15 menit.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,2±0,2.
A.10.Pseudomonas Agar P Komposisi Pancreatic digest of gelatin 20,0 g Magnesium klorida anhidrat 1,4 g Kalium sulfat anhidrat 10,0 g Agar 15,0 g Gliserin 10,0 mL Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen padat ke dalam air, dan tambahkan gliserin.
Panaskan, goyang secara teratur, dan didihkan selama 1 menit untuk melarutkannya.
Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai.
Sterilisasi dengan otoklaf pada 121C selama 15 menit.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,2±0,2.
A.11.Fluid Soybean Casein Digest Komposisi Pancreatic digest of casein 15,0 g Papaic digest of soybean meal 5,0 g Natrium klorida 5,0 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen (media lengkap yang dikeringkan) satu persatu ke dalam air mendidih sampai terlarut sempurna. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121ºC selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,3±0,2.
www.djpp.kemenkumham.go.id
A.12.Mannitol Salt Agar (Chapman Agar) Komposisi Beef extract 1,0 g Pancreatic digest of casein 5,0 g Pancreatic digest of beef 5,0 g Natrium klorida 75,0 g D-manitol 10,0 g Agar 15,0 g Phenol red 0,025 g Air 1000 mL Penyiapan Campur, kemudian panaskan dengan pengendapan bertahap dan didihkan selama 1 menit untuk memberi efek melarut. Pindahkan separti yang diinginkan dan sterilkan.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mendekati 7,4 ± 0,2.
A.13.Vogel Johnson Agar (VJA) Komposisi Pancreatic digest of casein 10,0 g Yeast extract 5,0 g Manitol 10,0 g Kalium fosfat dibasa 5,0 g Litium klorida 5,0 g Glisin 10,0 g Agar 16,0 g Merah fenol 0,025 g Air 1000 mL Penyiapan Didihkan larutan atau padatan selama 1 menit. Sterilkan dan dinginkan sampai antara 45 °C sampai 50°C dan tera dengan 20 mL larutan kalium telurit steril.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mendekati 7,2 ± 0,2.
www.djpp.kemenkumham.go.id
A.14. Baird Parker Agar (BPA) A.14.1. Media dasar Komposisi Pancreatic digest of casein 10,0 g Ekstrak ragi 1,0 g Ekstrak daging 5,0 g Natrium piruvat 10,0 g L-glisin 12,0 g Litium klorida 5,0 g Agar 12 g sampai 22 g1) Air sampai volume akhir 950 mL Penyiapan Larutkan komponen atau media dasar lengkap yang dikeringkan dalam air dengan cara pemanasan. Pindahkan media secara kuantitatif ke dalam labu ukur 100 mL atau botol dengan kapasitas yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121ºC selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mendekati 7,2 ± 0,2.
A.14.2.Larutan Kalium telurit Komposisi Kalium telurit (K2TeO3) 1,0 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan kalium telurit secara sempurna dalam air dengan pemanasan minimal.
Sterilkan dengan penyaring membran 0,22 µm. Larutan dapat disimpan paling lama 1 bulan pada suhu 3°C± 2°C. Buang larutan jika terbentuk endapan putih.
Padatan harus siap larut. Jika terdapat endapan putih dalam air, padatan tersebut harus dibuang.
A.14.3. Emulsi kuning telur (konsentrasi kurang lebih 20% atau mengikuti instruksi dari pabrik) www.djpp.kemenkumham.go.id
Jika cara penyiapan dari pabrik tidak ada, siapkan media dilakukan seperti berikut:
Gunakan telur ayam segar dengan kulit masih lengkap.
Bersihkan telur menggunakan sikat dengan detergen. Bilas dengan air mengalir, lalu disinfektan telur dengan merendamnya dalam etanol 70% selama 30 detik dan biarkan kering di udara, atau semprot dengan alkohol yang dilanjutkan dengan sterilisasi dengan api. Semua proses dilakukan secara aseptik, pecahkan telur dan pisahkan kuning terlur dengan mengeluarkan putihnya dengan berulang-ulang melalui kulitnya. Tempatkan kuning telur pada alat gelas steril dan tambahkan air steril 4 kali volume kuning telur dan kocok.
Panaskan campuran pada 47°C selama 2 jam dan biarkan selama 18 jam sampai 24 jam pada suhu 3°C±2°C biarkan terbentuk endapan. Dengan cara aseptik, media cair supernatan diambil dan dimasukkan kedalam alat gelas steril untuk digunakan.
Emulsi disimpan pada suhu3°C±2°C paling lama 72 jam A.14.4. Media lengkap Komposisi Media dasar (A.14.1) 100 mL Larutan Kalium telurit (A.14.2) 1,0 mL Emulsi kuning telur (A.14.3) 5,0 mL Penyiapan Lelehkan media dasar (A.14.1) kemudian dinginkan hingga suhu kira-kira 47°C. Pada kondisi aseptik, kedua larutan (A.14.2 dan A.14.3) masing-masing di panaskan pada 47°C, campur.
A.15.
Corn Meal Agar (CMA) dengan 1% Polisorbat 80 Komposisi Infusion from corn meal 50,0 g Agar 15,0 g Polisorbat 80 10,0 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan komponen atau media lengkap yang dikeringkan dalam air dengan cara mencampur dan memanaskan. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
www.djpp.kemenkumham.go.id
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus 6,0±0,2.
A. 16. Potato Dextrose Agar (PDA) Komposisi Ekstrak kentang 4,0 g Glukosa 20,0 g Agar 15 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen atau medium dehidrat dalam air dengan cara mencampur dan memanaskan. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus 5,6±0,2.
A.17. Glucose and Peptone added Lecithin Polysorbate 80 (GPLP 80 Broth) Komposisi Glukosa 20,0 g Ekstrak ragi 2,0 g Magnesium sulfat 0,5 g Pepton 5,0 g Kalium hidrogen fosfat dibasa 1,0 g Lesitin 1,0 g Polisorbat 80 7,0 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen atau medium dehidrat dalam air mendidih untuk melarutkan secara sempurna. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus 5,7±0,2.
APENDIKS B Pengencer Penetral Lain www.djpp.kemenkumham.go.id
B.1.
Lechitin Polysorbate (LP) Komposisi Polipepton 1,0 g Lesitin telur 0,7 g Polisorbat 80 20,0 g Air 980 mL Penyiapan Campur dan larutkan bahan sambil dipanaskan. Dinginkan hingga suhu 25°C sebelum pencampuran. Pindahkan larutan ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,2± 0,2.
B.2.
Modified Letheen Broth (MLB) Komposisi Peptic digest of meat 20,0 g Pancreatic digest of casein 5,0 g Ekstrak daging sapi 5,0 g Ekstrak ragi 2,0 g Lesitin 0,7 g Polisorbat 80 5,0 g Natrium klorida 5,0 g Natrium bisulfit 0,1 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan polisorbat 80 dan lesitin berturut-turut ke dalam air mendidih sampai membentuk larutan yang sempurna.
Larutkan komponen lainnya sambil dipanaskan.
Campur perlahan hindari terbentuknya busa. Pindahkan ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,2 ± 0,2.
APENDIKS C Penetral Sifat Antimikroba dari Pengawet dan Cairan Pembilas Pengawet Senyawa kimia yang dapat menetralkan Contoh penetral yang sesuai dan cairan www.djpp.kemenkumham.go.id
pengawet aktivitas mikroba pembilas (untuk metode penyaringan membran) Senyawa Fenol :
Paraben, Fenoksietanol, Feniletanol, dll.
Anilida Lesitin, Polisorbat 80, Kondensat Etilen oksida dari fatty alcohol Surfaktan non ionik Polisorbat 80, 30g/L + lesitin 3 g/L Kondensat Etilen oksida dari fatty alcohol 7 g/L + lesitin 20 g/L + polisorbat 80, 4 g/L D/E Neutralizing brotha Cairan pembilas : air destilasi, tripton, 1 g/L + NaCl 9 g/L, polisorbat 80, 5 g/L Senyawa Amonium kuartener, Surfaktan kation Lesitin, Saponin polisorbat 80, Natrium dodesil sulfat Kondensat Etilen oksida dari fatty alcohol Polisorbat 80, 30 g/L + natrium dodesil sulfat, 4 g/L + lesitin, 3 g/L Polisorbat 80, 30 g/L + saponin 30 g/L + lesitin 3 g/L D/E Neutralizing Brotha Cairan pembilas : air destilasi, tripton 1 g/L + NaCl 9 g/L, polisorbat 80, 3 g/L Aldehid Formaldehid- released agents Glisin, histidin Lesitin, 3 g/L + Polisorbat 80, 30 g/L + L-histidin, 1 g/L Polisorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + L- histidin 1 g/L + L- sistin, 1 g/L D/E Neutralizing Brotha Cairan pembilas :
polisorbat 80, 3 g/L + L-Histidin 0,5 g/L Senyawa oksidasi Natrium tiosulfat Natrium tiosulfat 5 g/L Cairan pembilas :
natrium tiosulfat, 3 g/L www.djpp.kemenkumham.go.id
Isotiazolinon, Imidazol Lesitin, saponin Amina, sulfat, merkaptan, natrium bisulfit, natrium tioglikolat Polisorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lesitin, 3 g/L Cairan pembilas :
tripton 1 g/L + NaCl 9 g/L ; polisorbat 80, 5 g/L Biguanida Lesitin, saponin, polisorbat 80 Polisorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lesitin, 3 g/L Cairan pembilas :
tripton, 1 g/L + NaCl 9 g/L ; polisorbat 80, 5 g/L Metallic salts (Cu, Zn, Hg) Senyawa merkuri organik Natrium bisulfit, L- sistin Senyawa Sulfidril, asam tioglikolat Natrium tioglikolat, 0,5 g/L atau 5 g/L L-sistin, 0,8 g/L atau 1,5 g/L D/E Neutralizing Brotha Cairan pembilas :
Natrium tioglikolat, 0,5 g/L Catatan :
mengacu pada pH produk kosmetik dari penetral dapat ditambahkan pada nilai tertentu a D/E media penetral (media penetral Dey/Engley ) Lihat Apendiks E APENDIKS D Pengencer Lain D.1.
Buffered Peptone solution pH 7 Komposisi Meat peptone 1,0 g Natrium klorida 4,3 g Kalium fosfat monobasa 3,6 g Natrium fosfat dibasa dihidrat 7,2 g Air 1000 mL Penyiapan www.djpp.kemenkumham.go.id
Larutkan bahan dalam air mendidih, campur, kemudian dinginkan sampai suhu 25°C. Pindahkan ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,1 ± 0,2.
APENDIKS E Media Kultur Lain E.1.
LT Agar Komposisi Pancreatic digest of casein 15,0 g Papaic digest of soybean 5,0 g Natrium klorida 5,0 g Lesitin telur 1,0 g Polisorbat 80 5,0 g Oktosinol 9 1,0 g Agar 15,0 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan polisorbat 80, oktosinol 9, dan lesitin telur berturut-turut ke dalam air mendidih sampai larut sempurna. Larutkan komponen lain dengan pencampuran sambil dipanaskan. Campur perlahan hindari terbentuknya busa. Pindahkan ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,0 ± 0,2.
E.2.
Soybean Casein Digest Lecithin Polysorbate 80 (SCDLP 80 Broth) Komposisi Casein peptone 17,0 g Soybean peptone 3,0 g Natrium klorida 5,0 g Kalium hidrogen fosfat dibasa 2,5 g Glukosa 2,5 g Lesitin 1,0 g Polisorbat 80 7,0 g www.djpp.kemenkumham.go.id
Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen atau dehidrasi semua medium ke dalam air mendidih sampai terlarut sempurna. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121oC selama 15 menit.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,2 ± 0,2.
E.3.
D/E Neutralizing broth (Dey/Engley Neutralizing Broth) Komposisi Glukosa 10,0 g Soybean lecithin 7,0 g Natrium tiosulfat pentahidrat 6,0 g Polisorbat 80 5,0 g Pancreatic digest of casein 5,0 g Natrium bisulfit 2,5 g Ekstrak ragi 2,5 g Natrium tioglikolat 1,0 g Ungu Bromkresol 0,002 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen atau dehidrasi semua medium ke dalam air mendidih sampai terlarut sempurna. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121oC selama 15 menit.
Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,6± 0,2.
E.4. Soybean Casein Digest Lesitin Polysorbate 80 Agar (SCDLPA) untuk pendeteksi Komposisi Casein peptone 15,0 g Soybean peptone 5,0 g Natrium klorida 5,0 g Lesitin telur 1,0 g Polisorbat 80 7,0 g Agar 15,0 g Air 1000 mL Penyiapan www.djpp.kemenkumham.go.id
Larutkan semua bahan cara dipanaskan. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121oC selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 7,0± 0,2.
APENDIKS F Media Kultur Lainnya F.1. Gambaran Umum Media kultur apapun dapat digunakan jika telah dilakukan pengecekan dan validasi. Berikut adalah contoh-contoh media dengan formula yang sesuai.
F.2.
Media Agar untuk penghitungan F.2.1. Potato Dextrose Agar (PDA) dengan antibiotik Komposisi Ekstrak kentang 4,0 g Glukosa 20,0 g Agar 15 g Kloramfenikol 0,05 g Air 1000 mL Penyiapan Campur semua komponen dan pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi pH akan mencapai 5,6 ± 0,2 ketika diukur pada suhu ruang.
Sebagai alternatif, kloramfenikol dapat diganti dengan menggunakan 0,1 kalium benzilpenisilin dan 0,10 g tetrasiklin tiap liter media, ditambahkan sebagai larutan steril, sebelum digunakan.
F.2.2. Glucose Peptone Agar (GPA) dengan antibiotik Komposisi Glukosa 20,0 g Ekstrak ragi 2,0 g www.djpp.kemenkumham.go.id
Magnesium sulfat 0,5 g Pepton 5,0 g Kalium fosfat monobasa 1,0 g Agar 15,0 g Kloramfenikol 0,05 g Air 1000 mL Penyiapan Campur semua komponen dan pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Strerilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 5,7 ± 0,2.
Sebagai alternatif, kloramfenikol dapat diganti dengan menggunakan 0,1 kalium benzilpenisilin dan 0,10 g tetrasiklin tiap liter media, ditambahkan sebagai larutan steril, sebelum digunakan.
F.3.
Malt Extract Komposisi Malt extract 30,0 g Soya peptone, papaic digest of soybean meal 3,0 g Agar 15,0 g Kloramfenikol 0,05 g Air 1000 mL Penyiapan Larutkan semua komponen (termasuk kloramfenikol) atau media lengkap yang dikeringkan ke dalam air dengan pemanasan. Pindahkan media ke dalam wadah yang sesuai. Sterilisasi dengan otoklaf pada 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi dan pendinginan, ukur pH media pada suhu ruang, pH media harus mencapai 5,6 ± 0,2.
APENDIKS G G.1 Persiapan kultur murni G.1.1 Umum www.djpp.kemenkumham.go.id
Mulailah persiapan kultur murni dengan seleksi koloni pada media agar yang telah diinokulasi dengan sebuah pengenceran sampel uji atau dengan kultur Kemudian inokulasikan koloni terseleksi pada media agar non selektif. Setelah inkubasi, pilih koloni yang terpisah. Ulangi proses ini jika diperlukan Gunakan teknik plating yang di jelaskan pada G.1.2. Metode yang lain mungkin di butuhkan pada kasus tertentu.
G.1.2 Plating G.1.2.1 Umum Ambil sejumlah kecil dari permukaan koloni yang terpisah menggunakan ujung jarum ose steril Kemudian di plating baik secara langsung dengan sell yang ada di jarum ose atau setelah disiapkan suspensi selnya (A.1.2.3) G.1.2.2 Metode langsung : Contoh Gunakan ujung jarum ose, inokulasi, goreskan secara rapat ( close streak ) pada satu bagian sekitar sepertiga permukaan media agar. Sterilkan dan dinginkan jarum ose. Dari tepi area yang terinokulasi, buatlah seri-seri goresan yang lain, kurang rapat di bandingkan yang pertama, lebih dari setengah area permukaan tidak diinokulasi.
Ulangi proses di atas permukaan yang tersisa untuk membuat goresan yang lebih menyebar.
(lihat gambar A.1) G.1.2.3 Metode menggunakan pengenceran Suspensikan sel dalam 1 - 2 mL pengencer, masukkan jarum ose yang telah diinokulasi ke dalam permukaan cairan, kemudian campurkan dengan baik.
Sterilkan dan dinginkan jarum ose. Gunakan jarum ose, ambil sebagian kecil suspensi mikroba dan di proses seperti pada A.1.2.2.
G.1.3 Inkubasi Balik cawan petri yang telah diinokulasi dan letakkan dalam inkubator pada waktu dan suhu yang dipilih.
www.djpp.kemenkumham.go.id
G.1.4 Seleksi Setelah inkubasi, pilih koloni pada cawan petri yang terpisah bagus, baik untuk plating out selanjutnya atau pengujian yang akan dikerjakan.
Jika memungkinkan, pada uji akhir digunakan sel stemming dari satu koloni tunggal. Jika sel dari satu koloni tidak mencukupi, terlebih dahulu di subculture pada media cair atau media agar miring, subculture ini digunakan untuk pengujian yang dilakukan.
G.2 Pewarnaan Gram (Teknik modifikasi Hucker ) G.2.1 Umum Pewarnaan sel bakteri ini memberikan deskripsi morfologi bakteri dan klasifikasinya menjadi dua grup berdasarkan kemampuan bisa atau tidak mempertahankan warna ungu kristal violet selama kondisi pengujian. Perbedaan hasil ini disebabkan oleh adanya perbedaan struktur membran sel dari kedua grup dan ini juga berhubungan dengan perbedaan yang lain antara kedua grup.
Terdapat sejumlah cara untuk melakukan pewarnaan Gram, tapi kebanyakan mengikuti urutan seperti di bawah.
G.2.2 Larutan yang digunakan G.2.2.1 Umum Larutan yang terdapat secara komersial dapat digunakan. Dalam hal ini, ikutilah rekomendasi dari pabrik pembuatnya.
G.2.2.2 Larutan kristal violet Komposisi Kristal violet 2,0 g Etanol (95%) 20 mL Amonium oksalat 0,8 g Air 80 mL Penyiapan Larutkan kristal violet dalam etanol dan amonium oksalat dalam air. Campurkan kedua larutan itu dan biarkan bercampur selama 24 jam sebelum digunakan.
www.djpp.kemenkumham.go.id
G.2.2.3 Larutan iodium Komposisi Iodium 1,0 g Kalium iodida (KI) 2,0 g Air 100 mL Penyiapan Larutkan kalium iodida ke dalam 10 mL air, tambahkan iodida sedikit demi sedikit. Setelah terlarut, volumenya dibuat 100 mL dalam Erlenmeyer.
G.2.2.4 Larutan Safranin Komposisi Safranin O 0,25 g Etanol (95%) 10 mL Air 100 mL Penyiapan Larutkan safranin dalam etanol kemudian campurkan dengan air. Buatlah volume akhirnya menjadi 100 mL.
Ketika kristal violet digunakan, kestabilan larutan seharusnya diverifikasi.
Untuk verifikasi, campurkan satu tetes dari larutan kristal violet dengan satu tetes larutan iodin pada gelas benda untuk melihat reaksi kimianya.
Jika terlihat adanya kristalisasi, jangan gunakan larutan kristal violet.
G.2.2.5 Teknik Pewarnaan Setelah proses fiksasi (misalnya menggunakan api) lapisan bakteri di atas gelas benda mikroskop yang disiapkan dari kultur 18-24 jam, atau ketika media cair menjadi keruh, tutup lapisannya dengan larutan kristal violet (G.2.2.2.). Biarkan bereaksi selama 1 menit.
Lapisi kaca obyek dengan larutan iodium (G.2.2.3).
Biarkan bereaksi selama 1 menit. Cuci pelan-pelan kaca obyek (sambil dimiringkan) dengan air selama beberapa detik.
Tuang pelan-pelan dan secara kontinyu lapisan etanol (95%) di atas kaca obyek selama tidak lebih www.djpp.kemenkumham.go.id
dari 30 detik dan sampai warna ungu tidak terpancar lagi.
Cuci pelan-pelan kaca obyek (sambil dimiringkan) dengan air untuk menghilangkan etanol.
Lapisi kaca obyek dengan larutan safranin (G.2.2.4) selama 10 detik Bilas pelan-pelan kaca obyek dengan air Keringkan kaca obyek.
G.2.2.6 Interpretasi Uji preparat di bawah mikroskop.
Sel bakteri yang menampakkan warna biru atau violet merupakan Gram positif, sedangkan yang berwarna pink gelap sampai merah merupakan Gram negatif.
Untuk kultur murni dari tipe bakteri tertentu, baik sel Gram positif dan negatif dapat dilakukan pada mikroskop yang sama.
G.3 Uji katalase G.3.1 Umum Deteksi enzim katalase yang dapat mendekomposisi hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen, dapat ditetapkan menggunakan kultur cair, kultur agar atau koloni terpisah dalam media agar.
G.3.2 Dari kultur cair Tambahkan 0,5 mL larutan hidrogen peroksida 3% b/b ke dalam 1 mL kultur.
Amati terbentuknya gelembung oksigen (katalase positif) atau tidak terbentuk (katalase negatif) G.3.3 Dari kultur media agar Tutup kultur dengan menambahkan 1 - 2 mL larutan hidrogen peroksida 3% b/b.
Amati terbentuknya gelembung oksigen (katalase positif) atau tidak terbentuk (katalase negatif) G.3.4 Dari koloni Tempatkan secara terpisah 2 tetes larutan hidrogen peroksida 3% b/b pada kaca obyek.
www.djpp.kemenkumham.go.id
Ambil koloni dengan batang kaca steril atau batang plastik (tidak menggunakan bahan logam) dan buat emulsi yang tipis mulai dari satu atau dua tetes.
Amati terbentuknya gelembung oksigen (katalase positif) atau tidak terbentuk (katalase negatif). Jika terdapat keraguan tutup masing-masing tetes dengen kaca penutup dan bandingkan terjadinya gelembung di bawah kaca penutup.
Pengamatan dapat dilakukan secara makroskopi dan dengan mikroskop perbesaran rendah.
G.4 Uji Oksidase G.4.1 Umum Pendeteksian dari oksidase yang dapat memberikan hasil berupa perubahan warna dari senyawa selama proses oksidasi oleh aktivitas enzim.
G.4.2 Bahan kimia G.4.2.1 Komposisi N,’N,’N,’N’-Tetra metil 3-p-fenilendiamin dihidroklorida 1,0 g Air 100 mL G.4.2.2 Penyiapan Siapkan larutan pereaksi sesaat sebelum digunakan dengan melarutkan dalam air dingin.
Dapat digunakan disk atau stik yang terdapat di pasaran.
Kemudian ikuti rekomendasi dari pabrik pembuatnya.
G.4.2.3 Teknik Basahi satu lembar kertas saring dengan pereaksi. Ambil satu koloni kultur bakteri dari media agar dengan menggunakan jarum ose platina atau batang kaca atau plastik dan totolkan di atas kertas saring basah.
Dianjurkan tidak menggunakan jarum ose nikel atau krom karena dapat memberikan kesalahan positif.
G.4.2.4 Interpretasi Hasil Jika terdapat enzim oksidase, akan terbentuk warna ungu sampai merah keunguan dalam waktu 5-10 detik.
Jika warna tidak berubah setelah 10 detik, pengujian ini di anggap negatif.
www.djpp.kemenkumham.go.id
G.5 Penggunaan Uji Biokimia untuk Identifikasi Uji biokimia yang digunakan untuk identifikasi dapat dilakukan dengan cara konvensional atau menggunakan kit.
Uji biokimia dengan menggunakan kit mempunyai tingkat kehandalannya yang tidak sama, oleh karena itu sebelum digunakan harus divalidasi, kecuali telah divalidasi oleh pabrik.
APENDIKS H Tehnik Dasar Untuk Penghitungan dan Plating H.1 Inokulasi untuk metode tuang Siapkan media, cawan Petri, pengencer dan seri pengenceran untuk diuji dalam volume dan jumlah sesuai dengan rencana inokulasi yang akan dilakukan.
Dalam cawan Petri berdiameter 85-100 mm, diinokulasi dengan 1 mL suspensi awal dan/atau pengenceran contoh seperti yang disiapkan pada proses validasi (lihat prosedur penetralan aktivitas antimikroba produk) dan kemudian dituangkan 15-20 mL media agar (suhu tidak lebih dari 48°C).
Suspensi awal dan/atau pengenceran contoh dicampur dengan media, digoyang dengan hati-hati atau dimiringkan secukupnya supaya terdispersi dengan baik. Campuran dalam cawan Petri dibiarkan memadat pada suhu ruang.
H.2 Permukaan Inokulasi Dalam cawan Petri berdiameter 85-100 mm, dimasukkan 15-20 mL media agar (suhu tidak lebih dari 48°C). Media agar dibiarkan dingin dan memadat di dalam inkubator, selanjutnya 0,1 mL suspensi awal dan/atau pengenceran contoh disebarkan pada permukaan media.
H.3 Penyaringan Membran Sejumlah suspensi awal yang sesuai atau contoh yang telah diencerkan dituang ke dalam perangkat penyaring yang dilengkapi membran dengan ukuran pori 0,45 m, membran dibilas segera setelah penyaringan dan dipindahkan ke permukaan media agar.
APENDIKS I Persiapan dan Kalibrasi inokulum www.djpp.kemenkumham.go.id
I.1 Kultur dari Galur Pembanding Dalam rangka untuk memperbaiki hasil keberulangan dan reprodusibilitas, disarankan untuk menggunakan generasi ketiga (paling tidak yang kedua) dari subkultur yang ditumbuhkan pada media agar untuk menyiapkan inokulum bakteri. Untuk E. coli, P. aeruginosa, dan S.
aureus, menggunakan subkultur yang telah ditumbuhkan pada interval 18-24 jam. Untuk C. albicans, menggunakan subkultur pertama atau kedua subkultur yang ditumbuhkan selama 36-48 jam.
I.2 Preparasi suspensi sel Ambil 10 mL pengencer di dalam wadah 100 mL yang berisi 5 g glass beads. Pindahkan 1 sengkelit sel yang dipanen dari media agar ke dalam pengencer. Sel sebaiknya disuspensikan ke dalam pengencer dengan menimersikan sengkelit ke dalam pengencer dan gosokkan ke sisi –sisi tabung untuk mengeluarkan sel. Kocok tabung selama 2 sampai 3 menit (Jika memungkinkan gunakan pengocok otomatis). Keluarkan bagian paling atas dari suspensi (hindari kontak dengan bantalan kaca) dan pindahkan suspensi yang terkandung dalam wadah steril.
I.3 Kalibrasi dari suspensi Tambahkan sejumlah sel dalam suspensi sebanyak 1 x 108 cfu/mL sampai 3 x 108 cfu/mL (dengan C. albicans sebanyak 1 x107 cfu/mL sampai 3 x 107 cfu/mL) menggunakan pengencer mengacu pada hasil data kalibrasi dalam laboratorium.
Sebagai contoh, gunakan spektrometer (panjang gelombang (620±20) nm ) dan menggunakan kuvet yang kecil berukuran 10 mm. Ukur absorbansinya dari seri pengenceran suspensi dan jika diperlukan, encerkan larutan untuk mendapatkan absorbansi diantara nilai yang ditentukan. Nilai densitas optik yang sesuai didapatkan antara 0,150 dan 0,460 mengacu pada strain.
ACUAN
1. Anonim
(2001) General Test-Microbial Limit Test, dalam Japanese Pharmacopoeia 14 ed.
2. Anonim
(2002) Microbiological Examination of non-sterile products, dalam European Pharmacopoeia 4th ed., Council of Europe.
3. Anonim (2005) Microbial Limit Test, dalam US Pharmacopoeia 28 ed.
4. Atlas, R. M., and Parks, L. C. (1993) Handbook of microbiological media, CRC Press, Boca Raton.
www.djpp.kemenkumham.go.id
5. COLIPA (1997) Guidelines on Microbial Quality Management, European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association.
6. CTFA (2001) Microbiology Guidelines, Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association.
7. EN 1040, Chemical disinfectants and Antiseptics - Basic bactericidal activities.
8. EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of microbial strains used for the determination of bactericidal and fungicidal activity
9. FDA (1995) Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, U.S Food and Drug Administration.
10. ISO 18415:2007, Cosmetic - Microbiology - Detection of specified and non specified microorganism.
11. ISO 21149:2006, Cosmetics – Microbiology - Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria.
12. ISO 21150:2006, Cosmetics-Microbiology-Detection of Escherichia coli.
13. ISO 22717:2006, Cosmetics - Microbiology – Detection of Pseudomonas aeruginosa.
14. ISO 22718:2006, Cosmetics – Microbiology - Detection of Staphylococcus aureus.
15. Singer, S. (1987) The use of Preservative Neutralizers in Diluents and Plating Media. Cosmetics and Toiletries, 102: 55-60
16. EN 13624, Chemical disinfectants and antiseptics-Quantitative suspension test for the evaluation of fungicidal activity of chemical disinfectants for instrument used in the medical area- Test methode and requirements (phase 2, step 1.
17. ISO 18415:2007 1>, Cosmetic - Microbiology - Detection of candida albicans.
KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH www.djpp.kemenkumham.go.id
METODE ANALISIS UJI EFEKTIVITAS PENGAWET DALAM KOSMETIKA
1. Ruang lingkup Pedoman ini digunakan untuk MENETAPKAN efektivitas antimikroba meliputi penentuan kesesuaian dan kinerja minimal pengawet dalam kosmetika.
2. Prinsip
2.1 Uji tantang terhadap produk bebas cemaran dengan menggunakan mikroba baku yang telah ditetapkan, kemudian produk yang telah diinokulasi tersebut disimpan pada suhu yang telah ditetapkan.
2.2 Penghitungan jumlah mikroba baku yang bertahan hidup dalam produk yang diuji, pada interval waktu yang ditentukan dengan metode angka lempeng.
2.3 Penentuan produk yang memenuhi kriteria, merupakan produk yang menggunakan pengawet yang sesuai, baik untuk proses pembuatan maupun penggunaan oleh konsumen.
2.4 Penentuan produk yang tidak memenuhi kriteria, merupakan produk yang tidak menggunakan pengawet yang sesuai.
3. Peralatan
3.1. Biohazard cabinet
3.1. Otoklaf
3.1. Oven
3.1. Inkubator suhu (35 ± 2)oC dan (25 ± 2)oC
3.1. Vortex mixer
3.1. Butir kaca (glass beads)
3.1. Pipet ukur berskala
3.1. Cawan Petri
3.1. Hemositometer dan mikroskop fase-kontras (jika ada)
3.1. Spektrofotometer/kolorimeter (jika ada)
3.1. Alat hitung koloni (colony counter)
3.1. Botol media
3.1. Tabung reaksi Lampiran 2 Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik INDONESIA Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 www.djpp.kemenkumham.go.id
3.1. Jarum inokulasi (loop) atau batang kaca bengkok (spreader)
3.1. Pembakar Bunsen (bacticinerator)
3.1. Tangas air
3.1. Timbangan top-loading
3.1. pH meter
3.1. Mc. Farland (BaSO4) no.2 (jika tersedia)
4. Media dan Pereaksi Media bentuk kering dengan fungsi setara, yang telah diuji sterilitas dan kemampuannya dalam menumbuhkan mikroba baku yang sesuai, terdiri dari:
4.1 Nutrient Agar atau yang setara (Tryptic Soy Agar/TSA)
4.2 Letheen Agar atau Tryptic Soy Agar + 1% Tween 80 (TSAt)
4.3 Mycophil Agar pH 4,7 atau Potato Dextrose Agar + antibiotik (PDAa)/SDAa atau Sabouraud Dextrose Agar + 1% Tween 80 (SDAt)
4.4 Letheen Broth atau Peptone Salin + 1% Tween 80
4.5 Larutan Dapar Klorida atau yang setara
4.6 Larutan Pengencer 1 steril (0,1% Peptone dalam NaCl 0,9%)
4.7 Larutan Pengencer 2 steril (0,05% Tween 80 dalam NaCl 0,9%)
5. Mikroba Uji
5.1 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, CIP 82.118, atau yang setara
5.2 Staphylococcus aureus ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83, NCTC 10788)
5.3 Candida albicans ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72)
5.4 Enterobacter aerogenes ATCC 13048
5.5 Aspergillus niger ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83)
6. Pemeliharaan Mikroba Uji Mikroba uji dipelihara pada media yang sesuai:
6.1 Bakteri dengan Nutrient Agar (TSA atau yang setara)
6.2 Kapang dan khamir dengan Mycophil Agar pH 4,7 (PDAa/SDAa atau yang setara).
7. Prosedur
7.1 Penyiapan Mikroba Uji
7.1.1 Mikroba hidup yang digunakan dalam uji harus tidak boleh lebih dari turunan kelima biakan asli ATCC.
www.djpp.kemenkumham.go.id
7.1.2 Goreskan stok biakan Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, dan Enterobacter aerogenes pada agar miring TSA dan inkubasi pada 35 2oC selama 18-24 jam.
7.1.3 Goreskan stok biakan Candida albicans pada agar miring SDAa dan inkubasi pada 25 2oC selama 48 jam.
7.1.4 Goreskan stok biakan Aspergillus niger pada agar miring SDAa dan inkubasi pada 25 2oC selama 7-14 hari atau sampai sporulasi sempurna.
7.2 Pemanenan Biakan Mikroba Uji
7.2.1 Cuci setiap biakan bakteri dan khamir dengan 2 x 2,5 mL larutan pengencer 1; dan biakan kapang dengan 2 x 2,5 mL larutan pengencer 2, lepaskan biakan dari permukaan agar dengan bantuan butir kaca steril. Pindahkan suspensi ke dalam tabung reaksi steril dan campur menggunakan vortex mixer agar tersebar merata.
7.2.2 Sesuaikan setiap pencucian dengan pengencer yang sama untuk menghasilkan 108 cfu/mL suspensi bakteri dan 107 cfu/mL suspensi khamir dan kapang.
Bandingkan suspensi dengan larutan standar Mc.
Farland (BaSO4) no.2, pengukuran absorbansi atau metode lain yang berkaitan dengan Angka Lempeng Total (ALT) sebagaimana akan dijelaskan dalam poin 7.3 dan 7.4.
7.3 Penentuan Jumlah Bakteri Uji dengan Metode ALT-Cara Sebar Permukaan
7.3.1 Tuang sekitar 15 - 20 mL TSA yang telah dicairkan pada cawan Petri steril dan biarkan memadat.
7.3.2 Isi masing-masing dari 10 tabung steril dengan 9 mL larutan pengencer 1.
7.3.3 Inokulasi 1 mL dari masing-masing suspensi bakteri (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, dan Enterobacter aerogenes) ke dalam tabung reaksi pertama yang mengandung 9 mL pengencer 1 (tandai sebagai 10-1). Ulangi proses pengenceran 10-kali hingga 10-10. Campur menggunakan vortex mixer untuk menjamin distribusi yang homogen.
7.3.4 Pipet 0,5 mL suspensi dari pengenceran 10-4 hingga 10-10 dan sebarkan ke permukaan TSA, dilakukan secara duplo.
7.3.5 Setelah suspensi diserap oleh media, balikkan cawan dan inkubasi pada 35 2 oC selama 24-48 jam.
7.3.6 Catat pertumbuhan antara 30-300 koloni.
Total koloni merupakan hasil penjumlahan koloni dari kedua cawan Petri, dikalikan faktor pengenceran. Gunakan suspensi mengandung 108 cfu/mL bakteri uji.
7.3.7 Gunakan bakteri segera atau simpan di kulkas pada 2-8C selama tidak lebih dari 72 jam.
www.djpp.kemenkumham.go.id
7.4 Penentuan Jumlah Kapang dan Khamir Uji dengan Metode ALT- Cara Tuang
7.4.1 Cairkan SDAa dan jaga suhu pada 45-50C dalam tangas air.
7.4.2 Isi masing-masing 10 tabung reaksi steril dengan 9 mL pengencer (pengencer 1 untuk Candida albicans dan pengencer 2 untuk Aspergillus niger).
7.4.3 Inokulasi 1 mL Candida albicans ke dalam tabung reaksi pertama yang berisi pengencer 1 dan Aspergillus niger ke dalam tabung reaksi pertama berisi pengencer
2. Ulangi proses dengan menginokulasi 1 mL suspensi dari tabung reaksi pertama ke dalam tabung reaksi kedua. Lakukan seri pengenceran kelipatan 10 hingga 10-10.
Campur menggunakan vortex mixer untuk menjamin homogenitas contoh.
7.4.4 Pipet 1 mL suspensi dari pengenceran 10-4 hingga 10-10 ke dalam cawan petri steril, lakukan secara duplo. Tuang sekitar 15-20 mL SDAa yang telah dicairkan ke dalam setiap cawan, tutup, goyang perlahan dan biarkan memadat.
7.4.5 Inkubasi pada 25 2 o C selama 48 jam (khamir) dan 72 jam (kapang) dalam posisi cawan dibalik.
7.4.6 Catat pertumbuhan antara 30-300 koloni.
Total koloni merupakan rata-rata koloni dari kedua cawan Petri, dikalikan faktor pengenceran.
7.4.7 Gunakan suspensi yang mengandung 107 cfu/mL khamir dan kapang untuk uji.
7.4.8 Gunakan mikroba segera atau simpan di kulkas pada 2-8C selama tidak lebih dari 72 jam.
7.5 Penyiapan Contoh
7.5.1 Siapkan 5 x 100 g contoh dalam 5 wadah gelas yang sesuai.
Tandai dengan tepat (3 wadah untuk mikroba uji bakteri dan 2 wadah untuk kapang dan khamir).
7.5.2 Kosmetik cair Gunakan produk secara langsung untuk uji.
7.5.3 Krim dengan dasar air dan losion Larutkan menggunakan larutan dapar klorida dengan perbandingan sama (1:1).
Panaskan pada 40-45C dan homogenkan menggunakan vortex mixer dengan bantuan butir kaca
7.5.4 Padat dan serbuk Campur produk dengan larutan dapar klorida dengan perbandingan yang sama.
Panaskan pada 40-45C dan homogenkan menggunakan vortex mixer dengan bantuan butir kaca.
www.djpp.kemenkumham.go.id
7.5.5 Produk berbasis minyak/lemak Campur 100 g contoh dengan 20 g minyak mineral sehingga terbentuk pasta.
Tambahkan 80 mL larutan dapar klorida.
Panaskan pada 40-45C dan homogenkan menggunakan vortex mixer dengan bantuan butir kaca.
7.5.6 Aerosol Simpan seluruh wadah dalam refrigerator (2-8C) selama 30 menit. Pindahkan 50 g aerosol ke dalam wadah yang berisi 50 mL larutan dapar klorida. Homogenkan menggunakan vortex mixer dengan bantuan butir kaca.
7.6 Prosedur Uji
7.6.1 Contoh harus diverifikasi tidak adanya pertumbuhan bakteri, khamir dan kapang, menggunakan metode uji “Penetapan Angka Kapang Khamir dan Uji Angka Lempeng Total dalam Kosmetika“.
Hal ini harus dilakukan sebelum melangkah ke proses lebih lanjut.
7.6.2 Inokulasi masing-masing wadah contoh dengan 1 mL suspensi dari tiap mikroba uji yang mengandung 1,0 hingga 9,9 x 106 cfu/mL (untuk bakteri) atau 1,0 hingga 9,9 x 105 cfu/mL (untuk khamir dan kapang) [volume suspensi sebaiknya tidak melebihi 1% dari jumlah contoh yang diuji]. Homogenkan menggunakan vortex mixer.
7.6.3 Pindahkan masing-masing 20 g dari contoh yang telah diinokulasi (sebagaimana tercantum dalam 7.6.2) ke dalam 4 wadah yang berbeda untuk diuji dalam jangka waktu 2, 7, 14 dan 28 hari.
Untuk tujuan validasi, uji kontrol harus dilakukan bersamaan dengan uji contoh: hari ke-0, 2, 7, 14, dan 28
7.6.3.1Inokulasi 100 g contoh tanpa pengawet atau 100 g larutan fisiologis NaCl steril yang mengandung 1% Tween 80 dengan 1 mL suspensi dari salah satu mikroba uji untuk menghasilkan 1,0 hingga 9,9 x 106 cfu/mL (untuk bakteri) atau 1,0 hingga 9,9 x 105 cfu/mL (untuk khamir dan kapang) sebagai kontrol.
7.6.3.2Pindahkan 1 mL contoh dalam waktu 30 menit dari masing-masing wadah untuk diuji pada hari ke-0, 2, 7, 14 dan 28 hari. Lakukan pengujian dengan melakukan seri pengenceran kelipatan 10 menggunakan larutan pepton salin yang mengandung 1% polisorbat 80.
Catatan: contoh yang belum diuji disimpan pada suhu ruangan (20-25C) selama pengujian.
7.6.3.3Tentukan jumlah mikroba hidup dengan menggunakan metode ALT cara sebar permukaan pada TSAt untuk bakteri dan metode ALT cara tuang dengan menggunakan SDAt untuk khamir dan kapang. Lakukan secara duplo.
www.djpp.kemenkumham.go.id
7.6.3.4Inkubasi bakteri pada 35 ± 2C selama 24 - 48 jam, khamir dan kapang pada 25 ± 2C selama 3 - 5 hari.
Hitung jumlah mikroba yang bertahan hidup tiap g atau mL contoh.
7.6.3.5Identifikasi mikroba dengan pewarnaan Gram yang tepat.
7.7 Cara Perhitungan
7.7.1 Persentase Reduksi, dihitung dengan rumus berikut:
catatan:
t0 adalah jumlah koloni yang diperoleh dari hasil pengujian hari ke-0 ti adalah jumlah koloni yang diperoleh dari hasil pengujian hari ke-i (hari ke-2, ke-7, ke-14, dan ke-28)
7.7.2 Log Reduksi dihitung dengan rumus:
Log Reduksi= log jumlah inokulum (t0) – log jumlah pada interval produk (ti)
7.8 Interpretasi Data Pengawet harus menunjukkan aktivitas terhadap mikroba uji sebagai berikut:
7.8.1 Jumlah bakteri dan khamir harus menunjukkan penurunan sekurang-kurangnya 99,0% (2 log) pada hari ke 2 dan 99,9% (3 log) pada hari ke 7 untuk setiap mikroba uji dan tidak ada peningkatan lagi selama uji selanjutnya dalam variasi data yang normal.
7.8.2 Jumlah kapang seharusnya menunjukkan penurunan 90,0% (1 log) pada hari ke 14 dan 99,0% (2 log) pada hari ke 28.
Jumlah mikroba uji pada contoh uji kontrol seharusnya tidak menunjukkan hasil seperti pada 7.8.1 dan 7.8.2.
7.9 Presisi dan Bias Presisi dan bias metode ini belum ditetapkan.
Direkomendasikan adanya replikasi contoh.
KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH www.djpp.kemenkumham.go.id
Lampiran 3 Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik INDONESIA Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR CEMARAN LOGAM BERAT (ARSEN, KADMIUM, TIMBAL DAN MERKURI) DALAM KOSMETIKA
1. Ruang lingkup Metode ini menguraikan prosedur untuk penetapan kadar cemaran logam berat (arsen, kadmium, timbal dan merkuri) dalam kosmetika.
2. Prinsip Contoh didigesti dengan cara digesti basah atau digesti kering atau digesti gelombang mikro bertekanan tinggi (High Pressure Microwave Digestion) dan ditetapkan kadar logam berat seperti arsen (As), cadmium (Cd), timbal (Pb) dan merkuri (Hg) menggunakan Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrophotometer (GF-AAS) dan Flow Injection Analysis System - Atomic Absorption Spectrophotometer (FIAS-AAS).
3. Pereaksi Seluruh pereaksi yang digunakan harus pro analisis
3.1 Asam nitrat pekat
3.2 Asam klorida pekat
3.3 Larutan hidrogen peroksida 30 % v/v
3.4 Pereduksi untuk merkuri
3.4.1 Larutan timah (II) klorida 1,1% dalam larutan asam klorida 3% v/v
3.4.2 Larutan natrium borohidrida 0,2% dalam larutan natrium hidroksida 0,05 %
3.5 Larutan magnesium nitrat 50%
3.6 Air deionisasi, dengan resistivitas ≥18,2 Mohm
3.7 Larutan Modifier untuk GF-AAS
3.7.1 Untuk As: modifier Pd 1000 µg/mL
3.7.2 Untuk Pb dan Cd: buat campuran larutan Mg(NO3)2 6H20 0,2% dalam larutan asam nitrat 0,5% v/v dan larutan NH4H2PO4 0,2% dalam larutan asam nitrat 0.5 % v/v (1:1)
3.8 Pereaksi untuk perlakuan awal pengujian As: buat campuran larutan kalium iodida 10% dan larutan asam askorbat 10% (1:1) www.djpp.kemenkumham.go.id
4. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan adalah:
4.1 Kertas Whatman no.1 dan no.40
4.2 Tabung digesti bertutup ulir, 50 mL
4.3 Tanur
4.4 Alat digesti gelombang mikro dengan kondisi sebagai berikut:
Bentuk sediaan Daya Maksimum (W) Suhu Maksimum (oC) Tekanan maksimum (bar) Waktu (menit) Krim 800 200 75 50 Serbuk 1000 200 75 40 Lipstik 900 200 75 50
4.5 Tabung kuarsa atau tetrafluorometan (TFM) 50 mL
4.6 Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrophotometer (As, Cd, Pb) dengan kondisi sebagai berikut:
Unsur Panjang gelombang (nm) Pirolisis (oC) Suhu atomisasi (oC) Volume injeksi (µL) As 193,7 1250 2100 20 Cd 228,8 550 1550 20 Pb 283,3 550 1550 20
4.7 Flow Injection Analysis System - Atomic Absorption Spectrophotometer dengan kondisi sebagai berikut:
Unsur Teknik Panjang gelombang (nm) Zat pereduksi Pembawa Suhu atomisasi (oC) Volume injeksi (µL) As Hydride Generation Technique 193,7 NaBH4 0,2 % HCl 10 % v/v 900 500 Hg Cold Vapour Technique 253,7 SnCl2 1,1% atau NaBH4 0,2 % HCl 3 % v/v 300 500
4.8 Electrodeless Discharge Lamp atau Hollow Cathode Lamp: As, Cd, Pb, Hg www.djpp.kemenkumham.go.id
5. Prosedur
5.1 Penyiapan larutan baku kalibrasi Larutan baku persediaan As, Cd, Pb dan Hg dengan konsentrasi masing-masing 1000 µg/mL
5.1.1 As:
5.1.1.1 Untuk GF-AAS Buat larutan baku kalibrasi As dengan konsentrasi 5, 10, 20, 30 dan 50 µg/L dalam larutan asam nitrat 0,5% v/v.
5.1.1.2 Untuk FIAS-AAS (Hydride Generation Technique) - Buat Larutan baku kalibrasi As dengan konsentrasi 1 µg/mL.
- Pipet 200, 400, 600, 800 µL larutan baku, masukkan ke dalam masing-masing labu tentukur 100-mL dan lanjutkan seperti yang tertera pada Prosedur 5.3.
5.1.2 Cd: buat larutan baku kalibrasi Cd dengan konsentrasi 0,5; 1; 2; 3 dan 5 µg/L dalam larutan asam nitrat 0,5% v/v.
5.1.3 Pb: buat larutan baku kalibrasi Pb dengan konsentrasi 5; 10; 20;
30 dan 50 µg/L dalam larutan asam nitrat 0,5% v/v.
5.1.4 Hg: buat larutan baku kalibrasi Hg dengan konsentrasi 0,5; 1; 2;
3 dan 5 µg/L dalam larutan asam klorida 3% v/v.
5.2 Penyiapan larutan uji
5.2.1 Buat pereaksi blanko seperti penyiapan larutan uji tetapi tanpa penambahan contoh.
5.2.2 Buat larutan uji dengan salah satu dari metode sebagai berikut:
5.2.2.1 Alat digesti gelombang mikro (untuk As, Cd, Pb, Hg)
a. Timbang saksama 0,15 - 0,20 g contoh, masukkan ke dalam tabung kuarsa atau tetrafluorometan (TFM) 50 mL.
Hindari kontak dengan dinding tabung, tambahkan 3,0 mL asam nitrat pekat dan 1,0 mL larutan hidrogen peroksida 30% v/v.
Jika contoh mengandung talk atau pigmen, tambahkan 1 mL asam klorida pekat.
b. Tutup tabung dan diamkan selama 15 menit untuk menjamin reaksi berjalan sempurna. Digesti dalam microwave digestion system menggunakan program khusus.
c. Setelah didinginkan sampai suhu ruang, tambahkan 20 mL air deionisasi pada larutan digesti, bilas bagian www.djpp.kemenkumham.go.id
dalam dan bagian tutup, saring dengan kertas Whatman no.1. Tampung filtrat dalam labu tentukur 50-mL dan encerkan dengan air deionisasi sampai tanda.
5.2.2.2 Digesti kering/pengabuan (untuk As, Cd, dan Pb) - Timbang saksama lebih kurang 2,5 g contoh, masukkan ke dalam cawan porselen dan tambahkan 3 mL larutan magnesium nitrat 50%.
- Keringkan di atas tangas air, abukan residu terlebih dahulu dalam mantel pemanas sampai tidak terdapat asap, kemudian panaskan dalam tanur pada suhu 500oC selama 3 jam.
- Dinginkan, tambahkan 25 mL larutan asam klorida 6 M, saring ke dalam labu tentukur 50-mL dan encerkan dengan air sampai tanda.
Untuk penetapan As, lanjutkan seperti yang tertera pada 5.3.
5.2.2.3 Digesti basah (untuk Hg) (Perhatian: Teknik ini memberikan hasil perolehan kembali Hg yang rendah dibandingkan dengan teknik digesti gelombang mikro.) - Timbang saksama lebih kurang 0,5 g contoh, masukkan ke dalam tabung digesti bertutup dan tambahkan 7 mL asam nitrat pekat.
- Panaskan di atas lempeng pemanas pada suhu maksimum 60oC selama tidak kurang dari 3 jam.
- Dinginkan dan encerkan dengan air hingga 50 mL.
Biarkan selama 24 jam dalam lemari pendingin untuk krim dan lipstik. Saring larutan melalui kertas saring Whatman no. 40.
- Larutan digesti ini digunakan untuk analisis secara FIAS-AAS (Cold Vapour Mercury Technique).
5.3 Perlakuan awal untuk pengujian As
5.3.1 Pipet masing-masing 10 mL air deionisasi (sebagai blanko baku), pereaksi blanko, larutan baku, larutan uji ke dalam labu tentukur 100-mL.
5.3.2 Tambahkan 10 mL asam klorida pekat dan 10 mL pereaksi untuk perlakuan awal pengujian As, seperti yang tertera pada 3.8, pada masing-masing larutan dan biarkan selama 45 menit pada suhu www.djpp.kemenkumham.go.id
ruang.
Encerkan dengan air hingga tanda.
Konsentrasi akhir larutan baku berturut-turut adalah 2,0; 4,0; 6,0 dan 8,0 µg/L.
5.3.3 Larutan ini digunakan untuk analisis secara FIAS-AAS (Hydride Generation Technique)
5.4 Kurva kalibrasi Suntikkan larutan baku kalibrasi dan larutan modifier ke dalam alat GF- AAS (rasio injeksi larutan baku dan modifier = 20 µL : 5 µL) atau FIAS-AAS (Cold Vapour Technique) atau FIAS-AAS (Hydride Generation Technique) pada kondisi tertentu, seperti yang tertera pada 4.6 dan 4.7. Buat kurva antara respon (serapan atau tinggi puncak) dengan kadar dari masing- masing larutan baku.
5.5 Suntikkan larutan uji dan larutan modifier dengan rasio seperti pada
5.4 ke dalam alat GF-AAS atau FIAS-AAS (Cold Vapour Technique) atau FIAS-AAS (Hydride Generation Technique) dan rekam respon.
6. Penghitungan Hitung kadar As, Cd, Pb, Hg (µg/g) dalam contoh dengan persamaan garis regresi kurva kalibrasi, menggunakan rumus:
dimana Cu = Konsentrasi As, Cd, Pb, Hg (µg/L) dalam contoh yang dihitung dari kurva kalibrasi.
F = Volume larutan uji dalam mL Bu = Bobot contoh (g) dari larutan uji
7. Keterangan
7.1. Penetapan batas kuantitasi Logam Batas kuantitasi (µg/g) As Cd Pb Hg 2,5 1 10 0,5
7.2. Laporan hasil
7.2.1.
Jika hasil pengujian berada dibawah batas kuantitasi yang tertera pada tabel
7.1.
maka dilaporkan sebagai “dibawah batas kuantitasi”.
xF x Bu Cu 1000 1 www.djpp.kemenkumham.go.id
7.2.2.
Jika kadar logam tinggi, larutan uji (5.2) harus diencerkan sampai kadar dalam rentang kurva kalibrasi. Faktor pengenceran diperlukan jika sampel diencerkan lebih lanjut.
ACUAN ASEAN Cosmetic Method (ACM) THA 05 KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH www.djpp.kemenkumham.go.id
METODE ANALISIS IDENTIFIKASI ASAM RETINOAT DALAM KOSMETIKA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) A. IDENTIFIKASI SECARA KLT
1. Ruang lingkup Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi asam retinoat dalam kosmetika.
(Perhatian: Pada saat penanganan larutan baku dan contoh, seluruh personel terutama wanita hamil atau diduga hamil harus memperhatikan keamanan penanganan berbagai senyawa retinoat).
2. Prinsip Asam retinoat diidentifikasi secara KLT.
3. Baku Pembanding (BP) Asam retinoat BP. Simpan dibawah nitrogen dan terlindung dari cahaya, pada suhu ruang.
4. Pereaksi Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis.
4.1 Asam asetat glasial
4.2 Asam fosfomolibdat
4.3 Aseton
4.4 Etanol mutlak
4.5 Dietil eter
4.6 n-heksan
4.7 Metanol
4.8 Gas nitrogen
4.9 Sikloheksan
4.10Larutan pengembang :
4.10.1 Sistem A: campuran n-heksan - asam asetat glasial 0,33% dalam etanol mutlak (9:1) v/v
4.10.2 Sistem B: campuran n-heksan - aseton (6:4) v/v
4.10.3 Sistem C: campuran sikloheksan - eter - aseton - asam asetat glasial (54:40:4:2) v/v/v/v Lampiran 4 Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik INDONESIA Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 www.djpp.kemenkumham.go.id
4.11Larutan penampak bercak: asam fosfomolibdat 5% dalam etanol mutlak yang harus dibuat baru (berupa cairan jernih berwarna kuning).
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1 Bejana kromatografi
5.2 Kertas saring Whatman no. 41 atau yang setara
5.3 Lampu UV 254 nm
5.4 Lempeng KLT silika gel 60F254 siap pakai, 20 cm x 20 cm, tebal 0,25 mm
5.5 Penyaring membran PTFE (Politetrafluoroetilen) porositas 0,45 µm atau yang setara
5.6 Peralatan gelas tahan cahaya
5.7 Peralatan penampak bercak
5.8 Tabung sentrifus bertutup 30 mL
5.9 Vortex mixer
6. Prosedur (Catatan: Penimbangan dan pemipetan pada saat pembuatan larutan baku dan larutan uji harus dilakukan secara cepat dan hindarkan dari cahaya untuk meminimalkan penguraian asam retinoat.
Jika tidak tersedia peralatan gelas tahan cahaya, tabung dan bejana dapat dibungkus dengan aluminium foil).
6.1 Penyiapan larutan baku Timbang saksama lebih kurang 0,01 g Asam retinoat BP, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan metanol sampai tanda.
6.2 Penyiapan larutan uji
6.2.1 Produk krim Timbang lebih kurang 3 g contoh, masukkan ke dalam tabung sentrifus 30 mL, bungkus dengan aluminium foil, tambahkan 10 mL metanol dan campur menggunakan vortex mixer selama 5 menit. Dinginkan dalam es selama 15 menit dan saring melalui kertas saring Whatman no. 41 atau yang setara.
6.2.2 Produk berbasis air (larutan dan gel) Timbang lebih kurang 10 g contoh, masukkan ke dalam corong pisah. Untuk contoh gel, tambahkan dalam 5 mL air. Ekstraksi larutan dengan 50 mL n-heksan dan cuci ekstrak n-heksan dengan 10 mL air. Uapkan ekstrak dengan hembusan gas nitrogen sampai kering. Larutkan residu dalam 1 mL metanol dan saring melalui penyaring membran PTFE dengan porositas 0,45 µm.
(Catatan: Gunakan penyaring membran berdiameter kecil.) www.djpp.kemenkumham.go.id
6.3 Prosedur KLT
6.3.1 Produk krim
4.1.
Siapkan lempeng KLT dengan membuat batas penotolan dan batas eluasi lebih kurang 10 cm.
4.2.
Totolkan secara terpisah, masing-masing 5 hingga 20 µL larutan uji dan 5 µL larutan baku pada batas penotolan dari lempeng KLT.
4.3.
Kembangkan lempeng dalam bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sistem A. Angkat lempeng dan biarkan hingga kering. Amati bercak gelap di bawah penyinaran lampu UV.
4.4.
Semprot dengan larutan penampak bercak, akan tampak bercak berwarna biru tua pada nilai Rf yang menunjukkan adanya asam retinoat.
4.5.
Hembuskan udara panas pada lempeng, akan tampak bercak berwarna hijau kebiruan dari asam retinoat.
4.6.
Jika hasil positif, menunjukkan adanya asam retinoat.
Ulangi pengujian seperti yang tertera pada
6.3.1.1 hingga
6.3.1.5 menggunakan larutan pengembang sistem B.
6.3.2 Produk berbasis air
4.1.
Isi dan jenuhkan bejana kromatografi dengan larutan pengembang sistem C yang dilapisi dengan kertas saring.
4.2.
Totolkan secara terpisah, masing-masing 5 hingga 20 µL larutan uji dan 5 µL larutan baku pada garis awal dari lempeng KLT. Biarkan sampai bercak kering.
4.3.
Kembangkan lempeng sampai jarak rambat pengembang kurang lebih 15 cm.
4.4.
Keringkan lempeng di udara dan amati lempeng di bawah penyinaran lampu UV 254 nm. Semprot lempeng dengan larutan penampak bercak.
4.5.
Hembuskan udara panas pada lempeng, akan tampak bercak berwarna hijau kebiruan dari asam retinoat.
4.6.
Bandingkan nilai Rf dan warna bercak yang diperoleh dari larutan uji dengan larutan baku.
7. Identifikasi
7.1 Hitung nilai Rf untuk masing-masing bercak Nilai Rf = Jarak tempuh bercak/Jarak tempuh larutan pengembang
7.2 Bandingkan bercak yang diperoleh dari larutan uji dengan larutan baku berdasarkan nilai Rf, warna bercak dibawah penyinaran lampu UV dan warna bercak setelah visualisasi dengan penyemprotan larutan penampak bercak.
www.djpp.kemenkumham.go.id
Sistem pengembang Perkiraan nilai Rf Batas deteksi (µg) Sistem A 0,1 – 0,3 0,125 Sistem B 0,5 Sistem C 0,4
7.3 Lakukan pengujian lebih lanjut secara KCKT, seperti yang tertera pada bagian B dan bandingkan waktu retensi yang diperoleh dari puncak larutan uji dengan larutan baku.
B. IDENTIFIKASI SECARA KCKT
1. Ruang lingkup Metode ini menjelaskan prosedur untuk identifikasi asam retinoat dalam kosmetika.
2. Prinsip Asam retinoat diidentifikasi secara kromatografi cair fase balik dengan deteksi ultra violet.
3. Baku Pembanding (BP) Asam retinoat BP. Simpan dibawah gas nitrogen dan terlindung dari cahaya.
4. Pereaksi Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis dan sesuai untuk KCKT
4.1 Air bidestilasi, 18 Mohm
4.2 Asam asetat glasial
4.3 Metanol
4.4 Fase gerak: campuran metanol-air-asam asetat glasial (85:15:0,5) v/v/v
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1 Peralatan gelas tahan cahaya
5.2 Tabung sentrifus bertutup 30 mL
5.3 Vial berwarna coklat
5.4 KCKT dengan detektor ultra violet 353 nm
5.5 Kolom analitik:
kolom baja tahan karat, 150 x 4,6 mm, berisi oktadesilsilana C18 dengan ukuran partikel 5 µm atau yang setara.
5.6 Penyaring membran PVDF(Polyvinylidene difluoride) porositas 0,45 µm atau yang setara
6. Prosedur (Catatan: Penimbangan dan pemipetan pada saat pembuatan larutan baku dan larutan uji harus dilakukan secara cepat dan hindari cahaya untuk meminimalkan penguraian asam retinoat. Jika tidak tersedia peralatan www.djpp.kemenkumham.go.id
gelas tahan cahaya, tabung dan bejana dapat dibungkus dengan alumunium foil).
6.1 Penyiapan larutan baku (larutan harus dibuat baru) Timbang saksama lebih kurang 10 mg Asam retinoat BP, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dalam 5 mL metanol, jika perlu sonikasi selama 1 hingga 2 menit dan encerkan dengan metanol sampai tanda (A). Buat pengenceran 1000 kali dengan cara: pipet 1 mL (A) ke dalam labu tentukur 10-mL, encerkan dengan metanol sampai tanda (B); pipet 1 mL (B) ke dalam labu tentukur 10-mL, encerkan dengan metanol sampai tanda (C); pipet 1mL (C) ke dalam labu tentukur 10-mL, encerkan dengan metanol sampai tanda (D).
Larutan (D) yang digunakan sebagai larutan baku.
(Catatan: Larutan ini digunakan dalam 24 jam.)
6.2 Penyiapan larutan uji
6.2.1 Produk Krim Timbang lebih kurang 1 g contoh, masukkan ke dalam tabung sentrifus 30 mL yang dibungkus dengan alumunium foil, tambahkan 10 mL metanol dan campur menggunakan vortex mixer selama 5 menit. Dinginkan dalam es selama 15 menit dan saring melalui penyaring membran berdiameter kecil dengan porositas 0,45 µm. Kumpulkan filtrat dalam vial berwarna coklat, buang beberapa mL filtrat pertama. Gunakan filtrat sebagai larutan uji.
6.2.2 Larutan jernih Saring larutan melalui penyaring membran berdiameter kecil dengan porositas 0,45 µm.
Kumpulkan filtrat dalam vial berwarna coklat, buang beberapa mL filtrat pertama. Gunakan filtrat sebagai larutan uji.
6.3 Prosedur KCKT
6.3.1 Kondisi :
Suhu kolom : 30°C Laju alir : 1,4 mL/menit Detektor : UV 353 nm Volume injeksi : 20 µL
6.3.2 Suntikkan secara terpisah larutan baku dan larutan uji ke dalam kromatograf.
6.3.3 Bandingkan waktu retensi yang diperoleh dari kromatogram larutan uji dengan larutan baku.
7. Perhitungan penetapan kadar Gunakan luas puncak asam retinoat pada kromatogram untuk menghitung kadar dalam contoh. Hitung kadar asam retinoat % (b/b) dalam contoh, dengan rumus:
100 xKbx Fb Fu x Bu Bb x Ab Au www.djpp.kemenkumham.go.id
dimana:
Au = Luas puncak asam retinoat larutan uji Ab = Luas puncak asam retinoat larutan baku Bb = Bobot baku Bu = Bobot contoh Fu = Faktor pengenceran larutan uji Fb = Faktor pengenceran larutan baku Kb = Kemurnian baku 100 = Faktor konversi untuk persentase
8. Keterangan
8.1 Batas deteksi lebih kurang 0,002 mg/mL.
8.2 Larutan uji dan larutan baku harus dalam konsentrasi yang berdekatan untuk digunakan dalam perhitungan. Jika diperlukan, buat larutan baku yang lebih pekat atau larutan uji yang lebih encer.
Perbedaan luas puncak larutan uji dan larutan baku tidak lebih dari 10%.
8.3 Identifikasi asam isoretinoat.
Metode ini dapat digunakan untuk identifikasi asam isoretinoat (asam retinoat bentuk 13-cis).
8.4 Untuk konfirmasi kemurnian puncak dapat digunakan detektor Photo Diode Array (PDA).
C. KESIMPULAN Gabungkan hasil KLT dan KCKT untuk identifikasi adanya asam retinoat.
D. ACUAN ASEAN Cosmetic Method (ACM) SIN 01 KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH www.djpp.kemenkumham.go.id
METODE ANALISIS IDENTIFIKASI BAHAN PEWARNA YANG DILARANG DALAM KOSMETIKA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) A. IDENTIFIKASI SECARA KLT
1. Ruang lingkup Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika, yaitu:
Nomor CI Nama lain 12075 Jingga K1 (Pigment Orange 5) 13065 Kuning Metanil 45170 Merah K10 (Rhodamine B)
2. Prinsip Bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika diekstraksi dan diidentifikasi secara KLT.
3. Baku Pembanding (BP)
3.1 Jingga K1 BP
3.2 Kuning metanil BP
3.3 Merah K10 BP
4. Pereaksi Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis.
4.1 Air destilasi
4.2 Amonia 25%
4.3 Asam asetat glasial
4.4 Asam ortofosfat 85%
4.5 n-butanol
4.6 Diklorometan
4.7 N,N-dimetilformamida (DMF) Lampiran 5 Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik INDONESIA Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 www.djpp.kemenkumham.go.id
4.8 Etanol 96%
4.9 Etil asetat
4.10 n-heksan
4.11 Isobutanol
4.12 Isopropanol
4.13 Metanol
4.14 Petroleum eter (antara 40-60C atau 60-80C)
4.15 Pelarut campur: campuran N,N-dimetilformamida - asam ortofosfat (95:5) v/v yang dibuat baru.
4.16 Larutan pengembang:
Pewarna larut minyak dikembangkan dengan larutan pengembang Sistem A dan pewarna larut air dengan larutan pengembang lainnya.
4.16.1 Sistem A : diklorometan
4.16.2 Sistem B : campuran etil asetat-metanol-[amonia 25% - air (3:7)] (15:3:3) v/v/v yang dibuat baru.
4.16.3 Sistem C:
campuran etanol-air-isobutanol-amonia 25% (31:32:40:1) v/v/v/v
4.16.4 Sistem D: campuran isopropanol-amonia 25% (100:25) v/v
4.16.5 Sistem E: campuran n-butanol - etanol - air - asam asetat glasial (60:10:20:0,5) v/v/v/v
4.16.6 Sistem F: campuran etil asetat - n-butanol - amonia 25 % (20:55:25) v/v/v
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan, dan
5.1 Lempeng KLT silika gel 60 F254 siap pakai, ukuran 20 cm x 20 cm, tebal 0,25 mm
5.2 Bejana kromatografi
5.3 Pipa kapiler Micropipette (1-5 L)
5.4 Kertas saring
5.5 Penyaring membran PTFE, diameter 13 mm, porositas 0,45 m, atau yang setara
5.6 Vortex mixer
5.7 Lampu UV 254 nm dan 366 nm
5.8 Tangas air
6. Prosedur
6.1 Penyiapan larutan baku (Catatan:
Larutan baku yang pekat, akan memberikan bercak tambahan)
6.1.1 Larutan baku bahan pewarna larut minyak www.djpp.kemenkumham.go.id
Timbang saksama sejumlah Jingga K1 BP, larutkan dalam diklorometan atau pelarut campur hingga kadar 0,1 mg/mL dan sonikasi sampai homogen.
6.1.2 Larutan baku bahan pewarna larut air Timbang saksama sejumlah Kuning Metanil BP, dan Merah K10 BP, masing-masing dilarutkan dan diencerkan dengan metanol atau DMF atau pelarut campur hingga kadar 0,2 mg/mL.
6.2 Penyiapan larutan uji
6.2.1 Produk kosmetika berwarna Timbang saksama lebih kurang 0,1 g – 0,3 g contoh dan larutkan dalam 2 mL pelarut campur.
6.2.1.1 Untuk contoh yang diduga mengandung Jingga K1:
Lakukan ekstraksi dengan diklorometan. Jika perlu, panaskan pada suhu 90C selama 1 jam atau sampai larut.
6.2.1.2 Untuk contoh kosmetika yang mengandung minyak :
Lakukan ekstraksi lemak 2 kali, setiap kali dengan 5 mL n-heksan. Kumpulkan ekstrak n-heksan. Jika ekstrak berwarna, ekstraksi kembali dengan 2 mL pelarut campur dan buang lapisan n-heksan. Saring lapisan pelarut campur melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 m. Gunakan filtrat sebagai larutan uji.
6.2.2 Sediaan mandi dan produk kosmetika berbasis air lainnya
6.2.2.1 Timbang saksama lebih kurang 1 sampai 5 g contoh (tergantung konsentrasi warna pada contoh), tambahkan 20 mL DMF dan panaskan di atas tangas air selama 10 menit. Biarkan pada suhu ruang hingga dingin dan saring melalui kertas saring Whatman (kecepatan sedang sampai tinggi). Pewarna organik akan larut dalam DMF.
6.2.2.2 Lakukan ekstraksi terhadap lapisan DMF dengan 40 mL petroleum eter untuk menghilangkan kelebihan minyak. Uapkan lapisan DMF di atas tangas air sampai kering.
6.2.2.3 Jika lapisan petroleum eter berwarna, menunjukkan adanya pewarna larut minyak.
Uapkan lapisan petroleum eter sampai kering.
6.3 Prosedur KLT www.djpp.kemenkumham.go.id
6.3.1 Produk kosmetika berwarna
6.3.1.1 Lapisi bejana KLT menggunakan kertas saring, jenuhkan bejana KLT dengan larutan pengembang yang sesuai.
6.3.1.2 Siapkan lempeng KLT dengan membuat batas penotolan dan batas eluasi lebih kurang 15 cm, kecuali untuk larutan pengembang sistem A, lebih kurang 11 cm.
6.3.1.3 Totolkan secara terpisah, masing-masing 1 µL sampai 5 µL larutan baku dan sejumlah volume sama larutan uji (tergantung kepekatan warna) pada batas penotolan.
6.3.1.4 Kembangkan lempeng dalam masing-masing bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sampai batas eluasi pada suhu ruang.
6.3.1.5 Angkat lempeng dan keringkan pada suhu ruang.
6.3.2 Sediaan mandi dan produk kosmetika berbasis air lainnya (gel dan larutan)
6.3.2.1 Larutkan residu (lihat 6.2.2.2 dan 6.2.2.3) dengan 0,5-1 mL metanol dan saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 m.
6.3.2.2 Totolkan secara terpisah, sejumlah volume sama (1 µL sampai 5 µL) larutan baku dan larutan uji pada batas penotolan.
6.3.2.3 Untuk bahan pewarna larut air (kuning metanil, dan merah K10), kembangkan lempeng sampai batas eluasi, dalam masing-masing bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sistem B sampai sistem F.
6.3.2.4 Untuk bahan pewarna larut minyak (jingga K1), kembangkan lempeng sampai batas eluasi lebih kurang 11 cm dalam bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sistem A. Untuk pengujian pendahuluan, dapat digunakan larutan pengembang sistem B.
6.3.2.5 Angkat lempeng dan keringkan pada suhu ruang.
7. Identifikasi
7.1 Hitung nilai Rf untuk masing-masing bercak.
7.2 Bandingkan nilai Rf dan warna bercak pada pengamatan secara visual yang diperoleh dari larutan uji dan larutan baku.
7.3 Amati bercak Merah K10 di bawah penyinaran lampu UV, bercak berwarna terang yang menunjukkan adanya pewarna golongan ksanten.
www.djpp.kemenkumham.go.id
7.4 Nilai Rf yang tertera dalam tabel dibawah ini, merupakan harga perkiraan yang mungkin diperoleh :
Nomor CI Nama Pewarna Warna bercak Perkiraan nilai Rf pada sistem larutan pengembang A B C D E F CI 12075 Jingga K1 Jingga 0,4 - - - - - CI 13065 Kuning Metanil Kuning - 0,4 0,9 0,7 0,6 0,65 CI 45170 Merah K10 Pink cerah - 0,8 0,8 0,7 0,4 0,88
7.5 Buat kesimpulan awal mengenai identitas bahan pewarna.
Jika tampak bercak bahan pewarna yang dilarang dalam contoh, lakukan pengujian lebih lanjut secara KCKT seperti yang tertera pada bagian B (Catatan: Untuk pemurnian lebih lanjut, larutan pewarna dapat digoreskan sebanyak yang dapat dilakukan, untuk membentuk pita pada batas penotolan lempeng KLT. Kembangkan lempeng dalam bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sistem A untuk menghilangkan minyak.
Lempeng yang sama dapat dikembangkan lebih jauh dengan larutan pengembang sistem B yang akan memisahkan bahan pewarna larut air.
Kerok masing-masing pita pada lempeng KLT dan masukkan secara terpisah ke dalam Beaker glass. Lakukan ekstraksi bahan pewarna dari silika gel pada masing-masing pita dengan metanol, saring dan uapkan filtrat sampai kering. Lanjutkan pengujian seperti yang tertera pada 6.3).
8. Keterangan mengenai batas deteksi Bahan pewarna Batas Deteksi Baku (g/bercak) Produk kosmetika berwarna (g/g) Sediaan mandi (g/g) Jingga K1 0,02 133 - 400 0,4 - 4 Kuning Metanil 0,005 33 - 100 0,1 - 1 Merah K10 0,04 266 - 800 0,8 - 8 B. IDENTIFIKASI SECARA KCKT
1. Ruang lingkup www.djpp.kemenkumham.go.id
Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika, yaitu:
Nomor CI Nama lain 12075 Jingga K1 (Pigment Orange 5) 13065 Kuning Metanil 45170 Merah K10 (Rhodamine B)
2. Prinsip Bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika diidentifikasi secara kromatografi cair fase balik dengan deteksi cahaya tampak.
3. Baku Pembanding (BP)
3.1. Jingga K1 BP
3.2. Kuning metanil BP
3.3. Merah K10 BP
4. Pereaksi Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis atau derajat kemurnian KCKT.
4.1 Air bidestilasi
4.2 Asam ortofosfat 85%
4.3 Diklorometan
4.4 Kalium hidroksida
4.5 Metanol
4.6 N,N-Dimetilformamida (DMF)
4.7 n-heksan
4.8 Larutan tetrabutilamonium hidroksida (TBA) 20%
4.9 Pelarut campur:
campuran N,N-dimetilformamida-asam ortofosfat (95:5) v/v yang dibuat baru.
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1 KCKT dengan detektor berbagai panjang gelombang cahaya tampak dan detektor Photo Diode Array (PDA)
5.2 Penyaring membran PTFE, diameter 13 mm, porositas 0,45 m, atau yang setara
5.3 Penyaring nilon, porositas 0,45 m atau yang setara
5.4 Vortex mixer atau tangas ultrasonik
5.5 Tangas air
5.6 Kertas saring, Whatman (medium sampai cepat) www.djpp.kemenkumham.go.id
6. Prosedur
6.1 Penyiapan larutan baku
6.1.1 Larutan baku bahan pewarna larut minyak Timbang saksama sejumlah Jingga K1 BP larutkan dalam diklorometan atau pelarut campur hingga kadar 0,1 mg/mL dan sonikasi selama setengah jam atau sampai larut.
6.1.2 Larutan baku bahan pewarna larut air Timbang saksama sejumlah Kuning Metanil BP dan Merah K10 BP, masing-masing dilarutkan dan diencerkan dengan metanol atau N,N-dimetilformamida atau pelarut campur hingga kadar 0,2 mg/mL.
6.2 Penyiapan larutan uji Lakukan seperti yang tertera pada 6.2 dalam bagian A (Identifikasi secara KLT).
6.3 Prosedur KCKT
6.3.1 Fase gerak
6.3.1.1 Buat campuran larutan tetrabutilamonium 0,005 M - air (75:25) v/v
6.3.1.2 Buat larutan tetrabutilamonium 0,5 M, sebagai berikut:
- Larutkan 2,8 g kalium hidroksida dalam 10 mL air.
- Masukkan ke dalam labu tentukur 100-mL.
- Tambahkan 65 mL larutan tetrabutilamonium hidroksida 20%, encerkan dengan air sampai tanda.
- Atur pH hingga 7 dengan penambahan asam ortofosfat.
6.3.1.3Buat larutan tetrabutilamonium 0,005 M sebagai berikut:
Pipet 10 mL larutan tetrabutilamonium 0,5 M ke dalam labu tentukur 1000-mL, encerkan dengan metanol sampai tanda.
Larutan menjadi keruh.
Biarkan mengendap selama beberapa jam dan saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 m.
6.3.2 Kondisi Suhu oven kolom : 30C www.djpp.kemenkumham.go.id
Kolom : kolom baja tahan karat berisi oktadesil- silana C18, ukuran partikel 5 µm, 200 x 4,6 mm atau yang setara Laju alir : 1 mL/menit Detektor : 435 nm dan 535 nm Rentang spektra detektor : 275 sampai 760 nm PDA Volume injeksi : 20 L Waktu analisis : 35 menit
6.3.3 Suntikkan secara terpisah larutan baku dan larutan uji ke dalam kromatograf. Amati dan catat kromatogram. Ukur luas puncak.
Bandingkan waktu retensi yang diperoleh dari kromatogram larutan uji dengan larutan baku.
7. Identifikasi
7.1 Bandingkan waktu retensi dan spektrum yang diperoleh dari kromatogram larutan uji dengan larutan baku.
Waktu retensi dan spektrum yang sama antara larutan uji dengan larutan baku, menunjukkan adanya bahan pewarna dimaksud.
7.2 Panjang gelombang detektor dan waktu retensi baku bahan pewarna, sebagai berikut Bahan pewarna Panjang gelombang (nm) Perkiraan waktu retensi (menit) Jingga K1 535 13 Kuning metanil 435 3 Merah K10 535 6 Catatan :
- Kromatogram dan waktu retensi harus memberikan faktor kemiripan lebih dari 90%.
- Jika diduga mengandung bahan pewarna, tambahkan baku bahan pewarna ke dalam contoh. Puncak tunggal harus diperoleh untuk puncak yang diduga dan puncak baku bahan pewarna.
- Gunakan detektor Spektrometri Massa untuk konfirmasi.
www.djpp.kemenkumham.go.id
8. Keterangan mengenai batas deteksi Bahan pewarna Batas deteksi Baku (g/mL) Produk kosmetika berwarna (g/g) Sediaan mandi (g/g) Jingga K1 16 153 32 Kuning Metanil 3 70 6 Merah K10 40 800 80 C. KESIMPULAN Hasil dari pengujian KLT dan KCKT dapat digunakan untuk menyimpulkan adanya bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika.
D. ACUAN ASEAN Cosmetic Method (ACM) SIN 02 KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH METODE ANALISIS Lampiran 6 Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik INDONESIA Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 www.djpp.kemenkumham.go.id
IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR HIDROKINON DALAM KOSMETIKA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) A.
IDENTIFIKASI SECARA KLT
1. Ruang lingkup Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi dan penetapan kadar hidrokinon dalam kosmetika.
2. Prinsip Hidrokinon diidentifikasi secara KLT.
3. Baku Pembanding (BP) Hidrokinon BP
4. Pereaksi Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis.
4.1. Amonia 25%
4.2. Asam asetat glasial
4.3. Asam fosfomolibdat
4.4. Aseton
4.5. Etanol mutlak
4.6. Etanol 96% v/v
4.7. n-heksan
4.8. Perak nitrat
4.9. Toluen
4.10.Larutan pengembang
4.10.1.
Sistem A: n-heksan - aseton (3:2)
4.10.2.
Sistem B: toluen - asam asetat glasial (8:2)
4.11.Larutan penampak bercak:
4.11.1. Ke dalam larutan perak nitrat 5% dalam air, tambahkan amonia 25% hingga endapan yang terbentuk larut.
(Peringatan: jika disimpan, larutan tidak stabil dan bersifat eksplosif oleh karena itu harus segera dibuang setelah digunakan)
4.11.2. Larutan asam fosfomolibdat 5% dalam etanol mutlak.
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1. Lampu UV 254 nm www.djpp.kemenkumham.go.id
5.2. Lempeng KLT silika gel GF254 siap pakai, ukuran 20 cm x 20 cm, tebal 0,25 mm.
5.3. Tangas ultrasonik
6. Prosedur
6.1.Penyiapan larutan baku (larutan dibuat baru) Timbang saksama lebih kurang 0,02 g Hidrokinon BP, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, tambahkan dengan 5 mL etanol 96% v/v, lalu kocok sampai larut, kemudian encerkan dengan etanol 96% v/v sampai tanda.
(Catatan: Larutan ini stabil kurang dari 1 hari pada suhu ruang).
6.2.Penyiapan larutan uji Timbang saksama lebih kurang 1,5 g contoh di dalam Beaker glass 25 mL. Tambahkan 15 mL etanol 96% v/v sedikit demi sedikit, kemudian campur.
Tuang ke dalam labu tentukur 25-mL.
Homogenkan dalam tangas ultrasonik selama 10 menit, dan dinginkan labu hingga suhu ruang. Tambahkan etanol 96% v/v sampai tanda, lalu campur. Letakkan dalam tangas es hingga terjadi pemisahan lemak selama lebih kurang 10 menit. Saring melalui kertas saring.
6.3. Penyiapan larutan uji yang ditambahkan baku pembanding (spiked sample) Campur 1 mL larutan baku dengan 1 mL larutan uji, kemudian kocok.
6.4.Prosedur KLT
6.4.1. Aktifkan lempeng pada suhu 100C selama 10 menit.
6.4.2. Jenuhkan bejana kromatografi dengan masing-masing larutan pengembang.
6.4.3. Totolkan secara terpisah, sejumlah volume sama (20 L) larutan baku, larutan uji dan spiked sample pada lempeng.
Penotolan dapat dilakukan dua kali.
6.4.4. Kembangkan lempeng dalam bejana kromatografi di ruang gelap pada suhu ruang hingga jarak rambat mencapai lebih kurang 15 cm dari titik penotolan.
6.4.5. Pindahkan lempeng, dan keringkan pada suhu ruang.
6.4.6. Deteksi
6.4.6.1.
Amati lempeng di bawah penyinaran lampu UV 254 nm, dan tandai posisi bercak.
6.4.6.2.
Semprot lempeng dengan:
www.djpp.kemenkumham.go.id
- pereaksi perak nitrat, atau - pereaksi asam fosfomolibdat, dan panaskan lempeng pada suhu lebih kurang 100C selama 10 menit.
7. Identifikasi
7.1.Hitung nilai Rf untuk masing-masing bercak.
7.2.Bandingkan nilai Rf bercak yang diperoleh dari larutan uji dengan larutan baku, dan warna bercak dibawah penyinaran lampu UV serta warna bercak setelah penyemprotan dengan larutan penampak bercak.
7.3.Lakukan pengujian lebih lanjut secara KCKT.
8. Keterangan Di bawah kondisi seperti di atas, perkiraan nilai Rf adalah sebagai berikut Sistem A: Rf lebih kurang 0,5 Sistem B: Rf lebih kurang 0,2 - 0,3 B.
IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR SECARA KCKT
1. Ruang lingkup Metode ini menjelaskan prosedur untuk identifikasi dan penetapan kadar hidrokinon dalam kosmetika.
2. Prinsip Hidrokinon diidentifikasi secara KCKT fase balik dengan deteksi sinar UV.
3. Baku Pembanding (BP) Hidrokinon BP
4. Pereaksi Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis dan sesuai untuk KCKT
4.1. Air bidestilasi
4.2. Metanol
4.3. Fase gerak: metanol - air (55:45) v/v.
5. Peralatan www.djpp.kemenkumham.go.id
Peralatan laboratorium yang umum digunakan, dan:
5.1. Tangas air, suhu 60C
5.2. KCKT dengan detektor ultra violet
5.3. Kolom analitik: kolom baja tahan karat, 250 x 4,6 mm, berisi oktadesilsilana dengan ukuran partikel 5 µm atau yang setara.
5.4. Kertas saring Whatman no. 1, diameter 90 mm atau yang setara
5.5. Vortex mixer
5.6. Penyaring membran HVLP, porositas 0,45 m atau yang setara
5.7. Sentrifus
6. Prosedur
6.1. Penyiapan larutan baku (larutan harus dibuat baru) Timbang saksama lebih kurang 0,01 g Hidrokinon BP, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dalam 5 mL fase gerak dan encerkan dengan fase gerak sampai tanda. Pipet 1 mL larutan ke dalam labu tentukur 10-mL. Encerkan dengan fase gerak sampai tanda.
(Catatan:
Pengenceran disesuaikan dengan konsentrasi.
Dapat digunakan gelas amber).
6.2. Penyiapan larutan uji Timbang saksama lebih kurang 1 g contoh di dalam Beaker glass 25 mL, tambahkan sedikit demi sedikit 25 mL fase gerak, dan campur hingga homogen. Tuang ke dalam labu tentukur 50-mL.
Kocok menggunakan Vortex mixer selama 1 menit. Masukkan labu ke dalam tangas air pada suhu 60C selama 15 menit, kemudian dinginkan labu pada suhu ruang. Encerkan dengan fase gerak sampai tanda. Saring larutan menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,45 µm (Sebelum penyaringan, jika perlu, sentrifus lebih dahulu selama 10 menit). Gunakan filtrat sebagai larutan uji dalam waktu kurang dari 24 jam.
6.3. Prosedur KCKT
6.3.1. Kondisi:
Laju alir : 1,0 mL / menit Detektor : UV 295 nm Volume injeksi : 20 µL
6.3.2. Kesesuaian sistem www.djpp.kemenkumham.go.id
6.3.2.1. Suntikkan larutan baku dan rekam kromatogram.
Injeksikan 6 kali untuk memastikan luas puncak konstan.
Simpangan Baku Relatif (SBR) pada penyuntikan ulang kurang dari 1% untuk waktu retensi dan kurang dari 2% untuk luas puncak.
6.3.2.2. Pastikan hasil kromatogram larutan baku dan larutan uji sesuai persyaratan berikut ini:
- Daya pisah puncak (resolusi) antara dua puncak yang pemisahannya buruk, tidak kurang dari 0,90 dihitung dari rumus P = i / h, seperti di gambarkan berikut ini:
- Faktor asimetri (As) antara 0,9-1,5.
- Garis dasar (baseline) harus stabil
6.3.3. Suntikkan secara terpisah larutan baku dan larutan uji ke dalam kromatograf. Amati dan rekam kromatogram serta luas puncak.
6.3.4. Bandingkan waktu retensi yang diperoleh dari kromatogram larutan uji dengan larutan baku. Gunakan untuk identifikasi adanya hidrokinon.
7. Perhitungan penetapan kadar h P = i/ h i h a h/10 b Faktor asimetri (As) = b/a www.djpp.kemenkumham.go.id
Gunakan luas puncak hidrokinon pada kromatogram untuk menghitung kadar hidrokinon dalam contoh. Hitung kadar hidrokinon % (b/b) dalam contoh, dengan rumus:
dimana:
Au = Luas puncak hidrokinon larutan uji Ab = Luas puncak hidrokinon larutan baku Bb = Bobot baku Bu = Bobot contoh Fu = Faktor pengenceran larutan uji Fb = Faktor pengenceran larutan baku Kb = Kemurnian baku 100 = Faktor konversi untuk persentase
8. Keterangan
7.1.
Keberulangan (Repeatability) Untuk kandungan hidrokinon 2,0%, perbedaan antara 2 hasil penetapan secara pararel menggunakan contoh yang sama sebaiknya tidak melebihi 2% dari harga mutlak.
7.2.
Reprodusibilitas Untuk kandungan hidrokinon 2,0%, perbedaan antara 2 hasil penetapan menggunakan contoh yang sama dengan kondisi yang berbeda (laboratorium, operator, alat dan/atau waktu), sebaiknya tidak melebihi 2% dari harga mutlak.
7.3.
Catatan
7.3.1. Jika kandungan hidrokinon yang ditemukan lebih besar dari 2% dan diperlukan perkiraan kadar hidrokinon secara akurat, maka larutan uji harus diencerkan sampai diperoleh konsentrasi sama seperti larutan uji yang mengandung hidrokinon 2% dan ulangi penetapan.
Larutan uji dan larutan baku harus mempunyai konsentrasi yang mirip.
Perbedaan luas puncak larutan uji dan larutan baku tidak lebih dari 10%.
7.3.2. Untuk konfirmasi kemurnian puncak dapat digunakan detektor Photo Diode Array (PDA) C. KESIMPULAN 100 xKbx Fb Fu x Bu Bb x Ab Au www.djpp.kemenkumham.go.id
Hasil dari pengujian KLT dan KCKT dapat digunakan untuk menyimpulkan adanya hidrokinon dalam kosmetika.
D. ACUAN ASEAN Cosmetic Method (ACM) INO 03 KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH METODE ANALISIS IDENTIFIKASI SENYAWA KORTIKOSTEROID DALAM KOSMETIKA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) A.
IDENTIFIKASI SECARA KLT
1. Ruang lingkup Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi senyawa kortikosteroid:
hidrokortison asetat, deksametason, betametason, betametason 17-valerat dan triamsinolon asetonida dalam kosmetika.
2. Prinsip Senyawa kortikosteroid dalam contoh diekstraksi dan diidentifikasi secara KLT.
Lampiran 7 Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik INDONESIA Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 www.djpp.kemenkumham.go.id
3. Baku Pembanding (BP)
3.1.
Hidrokortison asetat BP
3.2.
Deksametason BP
3.3.
Betametason BP
3.4.
Betametason 17-valerat BP
3.5.
Triamsinolon asetonida BP
4. Pereaksi Seluruh pereaksi yang digunakan harus pro analisis
4.1.
Air destilasi
4.2.
Anisaldehida
4.3.
Asam asetat glasial
4.4.
Asam sulfat pekat
4.5.
Biru tetrazolium
4.6.
Diklorometan
4.7.
Etil asetat
4.8.
Metil asetat
4.9.
Metanol
4.10. Natrium hidroksida
4.11. Larutan asam klorida 0,5 M
4.12. Larutan amonium hidroksida 0,5 M
4.13. Larutan pengembang: buat campuran diklorometan-metil asetat- air (100:50:50) v/v/v, gunakan lapisan bawah dari campuran.
4.14. Larutan penampak bercak
4.14.1. Masukkan 50 mL asam asetat glasial ke dalam labu Erlenmeyer bertutup 100 mL, tambahkan 0,5 mL anisaldehida, dan 11 mL asam sulfat pekat. Kocok perlahan.
4.14.2. Penampak bercak lainnya Larutan biru tetrazolium basa: buat campuran larutan biru tetrazolium 0,2% dalam metanol dan larutan natrium hidroksida 12% dalam metanol (1:3) yang dibuat baru.
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1. Bejana kromatografi
5.2. Lampu UV 254 nm
5.3. Tabung sentrifus bertutup 30 mL
5.4. Lempeng KLT silika gel 60F254 siap pakai, tebal 0,25 mm
5.5. Oven www.djpp.kemenkumham.go.id
5.6. Penyaring membran PVDF(Polyvinylidene difluoride), porositas 0,45 µm atau yang setara
5.7. pH meter
5.8. Tangas air
5.9. Tangas ultrasonik
6. Prosedur
6.1 Penyiapan larutan baku
6.1.1 Larutan baku Timbang saksama lebih kurang 10 mg masing-masing baku pembanding, masukkan ke dalam masing-masing labu tentukur 10-mL.
Tambahkan 5 mL metanol dan sonikasi selama 5 menit. Encerkan dengan metanol sampai tanda.
6.1.2Larutan baku campuran Timbang saksama lebih kurang 10 mg setiap baku pembanding, masukkan ke dalam sebuah labu tentukur 10- mL. Tambahkan 5 mL metanol dan sonikasi selama 5 menit.
Encerkan dengan metanol sampai tanda.
6.2 Penyiapan larutan uji
6.2.1 Produk cair Pipet 15 mL contoh dan atur pH hingga 7 dengan larutan asam klorida 0,5 M atau larutan amonium hidroksida 0,5 M.
Lakukan ekstraksi 2 kali, setiap kali dengan 20 mL etil asetat. Buang lapisan air. Kumpulkan ekstrak (jika perlu disaring) dalam cawan penguap. Uapkan sampai kering di atas tangas air. Larutkan residu dalam 5 mL metanol dan saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
6.2.2 Produk krim Timbang saksama lebih kurang 5 g contoh, masukkan ke dalam tabung sentrifus dan larutkan dengan 20 mL metanol.
Panaskan di atas tangas air selama 10 menit dan kocok kuat selama 5 menit menggunakan pengocok.
Sentrifus pada kecepatan 3000-4000 rpm selama 10 menit dan masukkan dalam lemari pembeku selama 10 menit. Pindahkan dan uapkan beningan hingga kering di atas tangas air. Larutkan residu dalam 5 mL metanol dan saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
www.djpp.kemenkumham.go.id
6.3 Prosedur KLT
6.3.1 Jenuhkan bejana kromatografi dengan larutan pengembang.
6.3.2 Totolkan secara terpisah, sejumlah volume sama (lebih kurang 20 L) larutan baku dari masing-masing baku pembanding, larutan baku campuran dan larutan uji pada lempeng,
6.3.3 Kembangkan lempeng hingga jarak rambat larutan pengembang mencapai 15 cm dari batas penotolan.
6.3.4 Angkat lempeng dan keringkan pada suhu ruang.
6.3.5 Amati bercak di bawah penyinaran lampu UV 254 nm dan tandai posisi bercak.
6.3.6 Semprot lempeng dengan larutan penampak bercak anisaldehid dan biarkan lempeng sampai kering.
6.3.7 Masukkan lempeng ke dalam oven pada suhu 120C selama 10 menit dan amati bercak.
7. Identifikasi
7.1 Hitung nilai Rf untuk masing-masing bercak.
7.2 Bandingkan nilai Rf bercak yang diperoleh dari larutan uji dengan larutan baku, dan warna bercak dibawah penyinaran lampu UV serta warna bercak setelah penyemprotan dengan larutan penampak bercak.
Senyawa kortikosteroid Warna bercak Perkiraan nilai Rf Penampak bercak anisaldehid Penampak bercak biru tetrazolium Hidrokortison asetat Coklat tua Biru keunguan 0,4 Deksametason Abu-abu Biru keunguan 0,2 Betametason Biru keabu-abuan Biru keunguan 0,2 Triamsinolon asetonida Hijau kekuningan Biru keunguan 0,3 Betametason 17-valerat Ungu tua Biru keunguan 0,35
8. Keterangan
8.1.
Metode ini dapat juga digunakan untuk identifikasi senyawa kortikosteroid berikut; kortison asetat, prednisolon, prednison, flusinolon asetonida, betametason 21-valerat dan hidrokortison.
www.djpp.kemenkumham.go.id
8.2.
Jika terdapat senyawa kortikosteroid dalam contoh, lakukan pengujian lebih lanjut secara KCKT.
B.
IDENTIFIKASI SECARA KCKT
1. Ruang Lingkup Metode ini menjelaskan prosedur lebih lanjut untuk identifikasi senyawa kortikosteroid:
hidrokortison asetat, deksametason, betametason, betametason 17-valerat dan triamsinolon asetonida dalam kosmetika.
2. Prinsip Senyawa kortikosteroid dalam contoh diekstraksi dan diidentifikasi secara KCKT fase balik dengan deteksi ultra violet.
3. Baku Pembanding (BP)
3.1 Hidrokortison asetat BP
3.2 Deksametason BP
3.3 Betametason BP
3.4 Betametason 17-valerat BP
3.5 Triamsinolon asetonida BP
4. Pereaksi Seluruh pereaksi yang digunakan harus pro analisis dan sesuai untuk KCKT
4.1 Air bidestilasi
4.2 Asetonitril
4.3 Etil asetat
4.4 Larutan amonium hidroksida 0,5 M
4.5 Larutan asam klorida 0,5 M
4.6 Metanol
4.7 Fase gerak:
campuran asetonitril dengan air secara eluasi gradien.
Kondisi gradien:
Waktu (menit) Perbandingan (%) Asetonitril Air 0,01 - 15,00 30 70 15,01 - 21,00 60 40 www.djpp.kemenkumham.go.id
21,01 - 30,00 50 50 30,01 - 35,00 30 70 35,00 STOP
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1 Tangas air, suhu 60C
5.2 KCKT dengan detektor ultra violet
5.3 Kolom analitik: kolom baja tahan karat 250 x 4,6 mm, berisi oktadesilsilana dengan ukuran partikel 5 µm, atau yang setara
5.4 pH meter
5.5 Penyaring membran dengan porositas 0,45 µm
5.6 Tangas ultrasonik
6. Prosedur
6.1. Penyiapan larutan baku
6.1.1 Larutan baku Timbang saksama lebih kurang 10 mg masing-masing baku pembanding, masukkan ke dalam masing-masing labu tentukur 10-mL. Tambahkan 5 mL metanol dan sonikasi selama 5 menit. Encerkan dengan metanol sampai tanda.
Saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
6.1.2 Larutan baku campuran Timbang saksama lebih kurang 10 mg setiap baku pembanding, masukkan ke dalam sebuah labu ukur 10-mL.
Tambahkan 5 mL metanol dan sonikasi selama 5 menit.
Encerkan dengan metanol sampai tanda.
Saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
6.2. Penyiapan larutan uji
6.2.1 Produk cair Pipet 15 mL contoh dan atur pH hingga 7 dengan larutan asam klorida 0,5 M atau larutan amonium hidroksida 0,5 M. Lakukan ekstraksi 2 kali, setiap kali dengan 20 mL etil asetat. Buang lapisan air. Kumpulkan ekstrak (jika perlu disaring) dalam cawan penguap. Uapkan sampai kering di atas tangas air.
Larutkan residu dalam 5 mL metanol dan saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 µm..
www.djpp.kemenkumham.go.id
6.2.2 Produk krim Timbang saksama lebih kurang 5 g contoh, masukkan ke dalam labu sentrifus dan larutkan dengan 20 mL metanol. Panaskan di atas tangas air selama 10 menit dan kocok kuat selama 5 menit.
Sentrifus pada kecepatan 3000-4000 rpm selama 10 menit dan masukkan dalam lemari pembeku selama 10 menit. Pindahkan dan uapkan beningan hingga kering di atas tangas air. Larutkan residu dalam 5 mL metanol dan saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
6.3. Prosedur KCKT
6.3.1 Kondisi :
Laju alir : 1,2 mL/menit Detektor UV : 245 nm Volume injeksi : 20 µL
6.3.2 Kesesuaian sistem Suntikkan larutan baku dan rekam kromatogram. Injeksikan 6 kali untuk memastikan luas puncak konstan.
Simpangan baku relatif (SBR) pada penyuntikan ulang kurang dari 1% untuk waktu retensi dan kurang dari 2% untuk luas puncak.
6.3.3 Suntikkan secara terpisah, sejumlah volume sama larutan baku dari masing-masing baku pembanding, larutan baku campuran dan larutan uji pada kromatograf.
6.3.4 Bandingkan waktu retensi dari kromatogram yang diperoleh dari larutan uji dan larutan baku.
7. Identifikasi
7.1 Perbedaan waktu retensi larutan baku pembanding dan larutan uji tidak lebih dari 1%.
7.2 Perkiraan waktu retensi (tR) untuk senyawa kortikosteroid adalah sebagai berikut :
Senyawa kortikosteroid Perkiraan waktu retensi (menit) Betametason 15 Deksametason 16 Triamsinolon asetonida 19 Hidrokortison asetat 20 www.djpp.kemenkumham.go.id
Betametason 17-valerat 22
8. Batas deteksi dan batas kuantitasi Senyawa Kortikosteroid Batas deteksi Batas kuantitasi Baku (mg/ mL) Produk Baku (mg/mL) Produk Cair (g/mL) Krim (g/g) Cair (g/mL) Krim (g/g) Hidrokortison asetat 0,02 7 20 0,07 23 70 Triamsinolon asetonida 0,04 14 40 0,13 46 130 Betametason 0,05 17 50 0,15 58 150 Deksametason 0,05 17 50 0,16 62 160 Betametason 17- valerat - - - - - -
9. Keterangan Metode ini dapat juga digunakan untuk identifikasi senyawa kortikosteroid berikut; kortison asetat, prednisolon, prednison, flusinolon asetonida, betametason 21-valerat dan hidrokortison.
C.
KESIMPULAN Hasil dari pengujian KLT dan KCKT dapat digunakan untuk menyimpulkan adanya Hidrokortison asetat, Deksametason, Betametason, Betametason 17- valerat Dan Triamsinolon asetonida dalam kosmetika.
D.
ACUAN ASEAN Cosmetic Method (ACM) MAL 07 KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH www.djpp.kemenkumham.go.id
METODE ANALISIS IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR PENGAWET DALAM KOSMETIKA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) A.
IDENTIFIKASI SECARA KLT
1. Ruang lingkup Metode ini menjelaskan prosedur untuk identifikasi pengawet:
2- fenoksietanol, metil 4-hidroksibenzoat, etil 4-hidroksibenzoat, propil 4- hidroksibenzoat dan butil 4-hidroksibenzoat dalam kosmetika.
2. Prinsip Pengawet dalam contoh diekstraksi dan diidentifikasi secara KLT.
3. Baku Pembanding (BP)
3.1.
2-fenoksietanol BP
3.2.
Metil 4-hidroksibenzoat (metilparaben) BP
3.3.
Etil 4-hidroksibenzoat (etilparaben) BP
3.4.
n-propil 4-hidroksibenzoat (propilparaben) BP Lampiran 8 Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik INDONESIA Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 www.djpp.kemenkumham.go.id
3.5.
n-butil 4-hidroksibenzoat (butilparaben) BP
4. Pereaksi Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis
6.1.
Air destilasi
6.2.
Asam asetat glasial
6.3.
Aseton
6.4.
Dietil eter
6.5.
Etanol
6.6.
n-pentan
6.7.
Kalsium klorida dihidrat (CaCl2.2H2O)
6.8.
Larutan Asam klorida 4 M
6.9.
Larutan Kalium hidroksida 4 M
6.10. Larutan pengembang: campuran n-pentan-asam asetat glasial (88:12) v/v
6.11. Larutan penampak bercak: pereaksi Millon (raksa (II) nitrat), yang telah tersedia di pasaran.
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1. Bejana kromatografi (tidak dilapisi dengan kertas saring)
5.2. Pengalir udara panas (hot-air hair dryer)
5.3. Lampu UV 254 nm
5.4. Lempeng KLT silika gel 60 F254 siap pakai, ukuran 20 cm x 20 cm, tebal 0,25 mm (jika perlu gunakan lempeng dengan concentrating zone).
5.5. Oven suhu 105C
5.6. Tabung gelas bertutup ulir 50 mL atau yang setara.
5.7. Tangas air suhu 60C
5.8. Vortex mixer
5.9. Wollen paint roller, panjang lebih kurang 10 cm, diameter luar lebih kurang 3,5 cm. Tebal lapisan wool 2 hingga 3 mm. Jika perlu pangkas/ratakan woolnya. Lihat catatan pada 6.3.
6. Prosedur
6.1.
Penyiapan larutan baku Buat larutan pengawet 0,1% dalam etanol untuk setiap baku pembanding, kecuali untuk 2-fenoksietanol konsentrasi larutannya 1%.
6.2.
Penyiapan larutan uji:
www.djpp.kemenkumham.go.id
Timbang saksama lebih kurang 1 g contoh, masukkan ke dalam labu Erlenmeyer 125 mL. Tambahkan 4 tetes larutan asam klorida 4 M, tambahkan 40 mL aseton dan campur (lihat catatan di bawah).
Panaskan campuran pada suhu 60C selama lebih kurang 10 menit. Dinginkan dan kocok selama 1 menit dengan vortex mixer. Atur pH larutan hingga tidak lebih dari 3 dengan penambahan larutan asam klorida 4 M (gunakan kertas indikator pH). Kocok menggunakan vortex mixer selama 1 menit. Saring larutan melalui kertas saring ke dalam labu Erlenmeyer 125 mL.
Pipet 20 mL filtrat ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL, tambahkan 60 mL air, dan campur. Atur pH larutan hingga lebih kurang 10 dengan penambahan larutan kalium hidroksida 4 M (gunakan kertas indikator pH). Tambahkan 1 g kalsium klorida dihidrat, dan kocok. Saring larutan ke dalam corong pisah 250 mL yang berisi 75 mL dietil eter, dan kocok selama 5 menit. Biarkan hingga terjadi pemisahan fase. Buang lapisan atas (fase dietil eter). Kumpulkan lapisan air ke dalam corong pisah 100 mL. Atur pH larutan hingga lebih kurang 2 dengan penambahan larutan asam klorida 4 M. Tambahkan dietil eter 10 mL, dan kocok selama 5 menit. Biarkan hingga terjadi pemisahan. Buang lapisan air. Pindahkan 2 mL lapisan dietil eter ke dalam vial contoh 5 mL.
(Catatan:
Untuk produk kosmetika yang bersifat basa kuat, misalnya sabun mandi, tambahkan 20 tetes larutan asam klorida.
Tutup labu Erlenmeyer, panaskan campuran dengan hati-hati pada suhu lebih kurang 60C untuk memudahkan ekstraksi bahan pengawet ke dalam fase aseton dan kocok kuat selama 1 menit).
6.3.
Prosedur KLT
6.3.1.
Aktifkan lempeng pada 100C selama 10 menit. Totolkan 10 L dari tiap larutan baku dan 100 L larutan uji pada batas penotolan dari lempeng.
Jika perlu, dapat digunakan aliran udara untuk memudahkan penguapan pelarut.
6.3.2.
Pindahkan sejumlah volume larutan pengembang ke dalam bejana kromatografi yang sesuai.
6.3.3.
Tempatkan segera lempeng dalam bejana KLT tak jenuh dan kembangkan pada suhu kamar hingga larutan pengembang naik sekitar 15 cm dari batas penotolan.
www.djpp.kemenkumham.go.id
6.3.4.
Pindahkan lempeng dari bejana pengembang dan keringkan dengan udara panas menggunakan pengalir udara panas.
6.3.5.
Amati lempeng di bawah penyinaran lampu UV dan tandai posisi bercak.
6.3.6.
Panaskan lempeng dalam oven pada suhu 100C selama 30 menit untuk menghilangkan kelebihan asam asetat.
6.3.7.
Amati bercak pengawet pada lempeng KLT menggunakan pereaksi Millon, dengan mencelupkan paint roller ke dalam pereaksi Millon kemudian dioleskan ke permukaan lempeng KLT (Catatan: Sebagai alternatif, bercak dapat diamati dengan meneteskan satu tetes pereaksi Millon pada setiap bercak).
Ester dari asam 4-hidroksibenzoat tampak sebagai bercak warna merah dan 2-fenoksietanol sebagai bercak warna kuning.
(Catatan: asam 4- hidroksibenzoat itu sendiri kemungkinan ada dalam contoh sebagai pengawet atau hasil dekomposisi dari paraben, juga akan tampak sebagai bercak warna merah. Lihat 8.3 dan 8.4).
7. Identifikasi
7.1.
Hitung nilai Rf setiap bercak.
7.2.
Bandingkan nilai Rf bercak yang dihasilkan larutan uji dengan larutan baku dan warna bercak di bawah penyinaran lampu UV atau sesudah pengamatan secara visual.
7.3.
Buat kesimpulan awal tentang identitas pengawet.
Jika kemungkinan terdapat turunan paraben dalam contoh, lakukan pengujian lebih lanjut dengan KCKT.
8. Keterangan
8.1.
Penyemprotan dengan pereaksi Millon tidak dianjurkan karena sangat toksik.
8.2.
Senyawa lain yang mengandung gugus hidroksil dapat juga memberikan warna dengan pereaksi Millon.
8.3.
Tabel warna dan harga Rf yang dihasilkan dari beberapa pengawet yang menggunakan prosedur KLT dapat dilihat dalam:
N.
de Kruijf, M.A.H.
Rijk, L.A.
Pranato-Soetardhi dan A.
www.djpp.kemenkumham.go.id
Schouten (1987): Determination of preservatives in cosmetic products I:
Thin-layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J.
Chromatography 410, 395-411).
8.4.
Perkiraan nilai Rf yang tercantum dalam tabel dibawah ini digunakan sebagai indikasi nilai yang mungkin diperoleh :
Senyawa Rf Warna Metilparaben 0,12 Pink ++++ Etilparaben 0,17 Pink +++ Propilparaben 0,21 Pink ++ Butilparaben 0,26 Pink muda 2-fenoksietanol 0,29 Kuning lemon
8.5.
Jika pemisahan antara asam 4-hidroksibenzoat dan metil paraben atau benzil paraben dan etil paraben tidak berhasil, maka lakukan konfirmasi melalui pengujian secara KCKT dan bandingkan waktu retensi yang dihasilkan larutan uji dan larutan baku.
B.
IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR SECARA KCKT
1. Ruang lingkup Metode ini menjelaskan prosedur untuk identifikasi dan penetapan kadar pengawet:
2-fenoksietanol, metil 4-hidroksibenzoat, etil 4- hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoat dan butil 4-hidroksibenzoat dalam kosmetika.
2. Prinsip Pengawet dalam contoh diekstraksi dan diidentifikasi serta ditetapkan kadarnya secara KCKT fase balik menggunakan isopropil 4- hidroksibenzoat atau benzofenon sebagai baku internal.
3. Baku Pembanding (BP)
3.1 2-fenoksietanol BP
3.2 Metil 4-hidroksibenzoat (metilparaben) BP
3.3 Etil 4-hidroksibenzoat (etilparaben) BP
3.4 n-propil 4-hidroksibenzoat (propilparaben) BP
3.5 n-butil 4-hidroksibenzoat (butilparaben) BP
3.6 Isopropil 4-hidroksibenzoat (isopropilparaben) BP www.djpp.kemenkumham.go.id
3.7 Benzofenon BP
4. Pereaksi Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis dan sesuai untuk KCKT.
4.1. Air bidestilasi
4.2. Asetonitril
4.3. Etanol absolut
4.4. Larutan asam sulfat 2 M
4.5. Metanol
4.6. Tetrahidrofuran
4.7. Campuran etanol-air (9:1) v/v
4.8. Fase gerak:
campuran tetrahidrofuran-air-metanol-asetonitril (5:60:10:25) v/v/v/v
5. Peralatan Peralatan laboratorium yang umum digunakan, dan:
5.1. Tangas air, suhu pada 60C
5.2. KCKT dengan detektor UV 280 nm
5.3. Kolom analitik: kolom baja tahan karat berisi oktadesilsilana C18, ukuran partikel: 5 m, 250 x 4,6 mm atau yang setara
5.4. Labu kaca 100-mL bertutup atau yang setara
5.5. Penyaring membran PVDF (Polyvinylidene difluoride) atau HVLP, porositas 0,45 m, atau yang setara.
6. Prosedur
6.1. Penyiapan larutan baku
6.2.1. Larutan baku internal Timbang saksama lebih kurang 0,125 g isopropilparaben atau benzofenon, masukkan ke dalam labu tentukur 250- mL, larutkan dan encerkan dengan campuran etanol-air (9:1) v/v sampai tanda.
6.2.2. Larutan baku persediaan Timbang saksama masing-masing 0,05 g metil, etil, propil, butil 4-hidroksibenzoat dan 0,2 g 2-fenoksietanol dan masukkan ke dalam sebuah labu tentukur 100-mL.
Larutkan dalam 50 mL campuran etanol-air (9:1) v/v dan encerkan sampai tanda.
(Catatan: Simpan dalam lemari pendingin, semua larutan tersebut stabil selama 1 minggu.) www.djpp.kemenkumham.go.id
6.2.3.
Larutan baku (larutan dibuat baru)
6.1.3.1 Pipet 20 mL, 10 mL, 5 mL, 2 mL dan 1 mL larutan baku persediaan, masukkan masing-masing ke dalam labu tentukur 50-mL.
6.1.3.2 Tambahkan 10,0 mL larutan baku internal ke dalam masing-masing labu.
6.1.3.3 Tambahkan 1,0 mL larutan asam sulfat 2 M dan kocok sampai homogen.
6.1.3.4 Tambahkan campuran etanol-air (9:1) v/v sampai tanda.
6.1.3.5 Saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 m ke dalam vial.
6.2. Penyiapan larutan uji
6.2.1.
Timbang saksama 1 g contoh ke dalam labu Erlenmeyer bertutup 125 mL.
6.2.2.
Tambahkan 1,0 mL asam sulfat 2 M; 40,0 mL campuran etanol-air (9:1) v/v, batu didih dan 10,0 mL larutan baku internal yang mengandung isopropil hidroksibenzoat 0,05% atau benzofenon 0,05%.
Kocok kuat selama 1 menit sampai homogen.
6.2.3.
Panaskan di atas tangas air pada suhu lebih kurang 60C selama 5 menit.
6.2.4.
Dinginkan labu Erlenmeyer dengan air dingin mengalir dan simpan dalam lemari pendingin selama 1 jam. Jika perlu di sentrifus.
6.2.5.
Saring larutan melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 m ke dalam labu Erlenmeyer bertutup 125 mL .
6.2.6.
Pindahkan lebih kurang 2 mL filtrat ke dalam vial contoh 5 mL.
6.2.7.
Lakukan penetapan kadar terhadap larutan uji secara KCKT dalam waktu kurang dari 24 jam.
6.3. Prosedur KCKT
6.3.1. Kondisi :
Suhu kolom : 25C Laju alir : 1,5 mL/menit Detektor UV : 280 nm Volume injeksi : 20 µL
6.3.2. Kesesuaian sistem www.djpp.kemenkumham.go.id
6.3.2.1.
Suntikkan 6 kali sejumlah volume sama larutan baku internal dan/atau larutan baku. Simpangan baku relatif (SBR) pada penyuntikan ulang tidak lebih dari 2%.
6.3.2.2.
Penetapan faktor asimetrik (As) antara 0,9 hingga 1,5 (lihat pada 6.3.4.3) dan daya pisah puncak (resolusi) tidak kurang dari 0,9.
6.3.3. Pembuatan kurva kalibrasi
6.3.3.1.
Suntikkan setiap larutan baku ke dalam kromatograf dan rekam kromatogram.
6.3.3.2. Catat dan hitung rasio luas puncak larutan baku dengan larutan baku internal dari kromatogram.
6.3.3.3. Buat kurva antara rasio luas puncak dengan konsentrasi larutan baku masing-masing pengawet.
6.3.3.4. Tentukan linearitas kurva kalibrasi masing-masing pengawet.
6.3.4. Penetapan kadar
6.3.4.1.
Suntikkan larutan uji ke dalam kromatograf dan rekam kromatogram.
6.3.4.2.
Catat dan hitung rasio luas puncak dari pengawet yang diuji terhadap luas puncak baku internal dari kromatogram.
6.3.4.3.
Pastikan bahwa kromatogram yang dihasilkan larutan baku dan larutan uji sesuai dengan persyaratan uji kesesuaian sistem berikut :
ii.
Daya pisah puncak (resolusi) antara dua puncak yang pemisahannya buruk, tidak kurang dari 0,90 (Ketentuan pemisahan puncak, lihat gambar) iii.
iv.
Faktor asimetri (As) antara 0,9 - 1,5. (Ketentuan faktor asimetrik puncak, lihat gambar).
h P = i/h i h a h/10 b www.djpp.kemenkumham.go.id
- Garis dasar (baseline) harus stabil
7. Perhitungan Hitung kadar pengawet: 2-fenoksietanol, metil 4-hidroksibenzoat, etil 4-hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoat, butil 4-hidroksibenzoat % (b/b) dalam contoh dengan persamaan garis regresi kurva kalibrasi, menggunakan rumus:
dimana, bi = Konsentrasi (µg/mL) pengawet i dalam larutan uji yang dihitung dari kurva kalibrasi.
a = Bobot contoh (g) dari larutan uji.
8. Keterangan Telah dilakukan uji kolaborasi terhadap metode ini yang diikuti oleh 9 laboratorium terhadap tiga contoh. Tabel berikut berisi data: rata-rata % b/b (m), repeatability (r), reprodusibilitas (R) dari analit yang terkandung dalam ke 3 contoh tersebut.
Contoh 2-fenoksi- etanol 1- fenoksi- propan- 2-ol Metil parabe n Etil parabe n Propil parabe n Butil parabe n Benzil parabe n Krim vitamin m 1,124 - 0,250 0,0628 0,031 0,090 6 - r 0,016 - 0,018 0,0035 0,0028 0,004 4 - Faktor asimetri (As) = b/a 10000 51 x a bi www.djpp.kemenkumham.go.id
R 0,176 - 0,030 0,0068 0,0111 0,003 4 - Krim vanishing m 1,196 - 0,266 0,076 - - - r 0,040 - 0,003 0,002 - - - R 0,147 - 0,022 0,004 - - - Krim pijat m - 0,806 - - 0,180 0,148 0,152 r - 0,067 - - 0,034 0,013 0,015 R - 0,112 - - 0,078 0,012 0,016 C.
KESIMPULAN Hasil dari pengujian KLT dan KCKT dapat digunakan untuk menyimpulkan adanya 2-fenoksietanol, metil 4-hidroksibenzoat, etil 4-hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoat dan butil 4-hidroksibenzoat dalam kosmetika.
Kadar masing-masing pengawet dalam kosmetika dihitung dari hasil pengujian secara KCKT.
D.
ACUAN ASEAN Cosmetic Method (ACM) INO 04.
KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA, KUSTANTINAH www.djpp.kemenkumham.go.id